小鼠GITRaa22-153-Fc融合蛋白的表達(dá)及干預(yù)小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的研究.pdf

1、目的:
　　 克隆人IgGlFc段(hIgGlFc)基因,構(gòu)建pET32a(+)-mGITRaa22-153-HIgGlFc原核表達(dá)載體,并在體外表達(dá)、純化mGITRaa22-153-hIgGlFc(GITR-Fc)融合蛋白;建立小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,觀察GITR-Fc蛋白對(duì)CIA發(fā)病的影響,并尋找其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)采用PC

2、R的方法,擴(kuò)增MgGlFc基因,連接至PMD-18T載體,選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定。用酶切方法從陽(yáng)性T-A克隆中獲得hIgGlFc基因,連接至pET32a(+)-mGITRaa22-153(由本實(shí)驗(yàn)室保存)質(zhì)粒和pET32a(+)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至EcoliDH5a宿主菌,選擇陽(yáng)性菌落進(jìn)行增菌,抽提質(zhì)粒,并進(jìn)行酶切和PCR鑒定。將重組質(zhì)粒pET32a(+)-mGITRaa22-153-hIgGlFc和pET32a(+)-hIgGl

3、Fc分別轉(zhuǎn)化E.ColiRosetta宿主菌,通過(guò)PCR和酶切鑒定陽(yáng)性菌株,經(jīng)0.5mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá),表達(dá)蛋白經(jīng)Profinity IMAC Nickel柱純化、去除內(nèi)毒素,并通過(guò)Western blot進(jìn)行鑒定。
　　 (2)取等體積0.2g/L雞Ⅱ型膠原(CⅡ)與弗氏完全佐劑1∶1混合,充分研磨至混合物

4、完全乳化,取乳化后的CH于小鼠(100μgCⅡ/只)尾根部皮內(nèi)注射。第一次免疫當(dāng)日為0天,于免疫后第21天用CⅡ與弗氏不完全佐劑的乳化物加強(qiáng)免疫,建立CIA模型。將模型小鼠隨機(jī)分為CIA模型組(CIA)、CIA-目的蛋白組(CIA-GITR-Fc)和CIA-對(duì)照蛋白組(CIA-Fc)。于免疫第18天時(shí),通過(guò)尾靜脈分別注射80μg GITR-Fc蛋白及80μg對(duì)照蛋白,觀察小鼠發(fā)病進(jìn)程(臨床評(píng)分,CIA發(fā)病率,病理學(xué)檢查等);利用流式細(xì)胞

5、術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞的比例、數(shù)目變化;利用ELISPOT檢測(cè)脾臟和骨髓中抗CⅡ特異性抗體分泌細(xì)胞的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)成功構(gòu)建pET32a(+)-mGITRaa22-153-hIgGlFc重組質(zhì)粒和pET32a(+)-hIgGlFc重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定分別可見在1461bp和1047bp位置處出現(xiàn)條帶,并且測(cè)序結(jié)果與mGITRaa22-153基因和hIgGlFc基因序列完全一致。

6、r>　　 (2)將陽(yáng)性克隆載體轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta宿主菌,確定終濃度1.5mmol/LIPTG,溫度25℃,誘導(dǎo)時(shí)間6h為最佳誘導(dǎo)條件,通過(guò)Profinity IMAC Nickel柱純化目的蛋白純度＞90%,獲得原核表達(dá)的GITR-Fc蛋白和hIgGlFc(Fc)蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量大小分別為72KD、56KD。所得蛋白經(jīng)Western blot鑒定為GITR-Fe蛋白和Fc蛋白。
　　 (3)成功建立小鼠CIA模

7、型,關(guān)節(jié)炎發(fā)病率為80%。在關(guān)節(jié)炎模型第45天時(shí),GITR-Fc組小鼠的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率(27%)明顯低于對(duì)照蛋白組(100%)和CIA組(80%);病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)GITR-Fc組小鼠關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及骨的侵蝕較對(duì)照蛋白組和CIA組明顯減輕。ELISPOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照蛋白組和CIA組相比,GITR-Fc組脾臟中抗CⅡ特異性抗體分泌細(xì)胞數(shù)目明顯下降,結(jié)果有顯著差異(P＜0.01);與對(duì)照蛋白組和CIA組相比,GITR-Fc組骨髓中抗C

8、Ⅱ特異性抗體分泌細(xì)胞數(shù)目明顯下降,有顯著差異(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照蛋白組和CIA組相比,GITR-Fc蛋白組小鼠脾臟中B細(xì)胞比例(53.86±18.01%)明顯降低,有顯著差異(P＜0.05);與對(duì)照蛋白組和CIA組相比,GITR-Fc蛋白處理組小鼠脾臟中Tfh細(xì)胞比例(1.39±0.84%)明顯減少,有顯著差異(P＜0.05);同時(shí)根據(jù)計(jì)算發(fā)現(xiàn),GITR-Fc蛋白組小鼠脾臟中Tfh細(xì)胞數(shù)目(2.20×105±1.