轉(zhuǎn)錄因子T-bet特異性shRNA的研制及其對小鼠膠原誘導性關節(jié)炎的干預研究.pdf

1、研究目的：探討T-bet基因在DBA/1小鼠膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)發(fā)生發(fā)展過程中的作用，及其作為類風濕性關節(jié)炎治療靶點的可能性。
　　 研究方法：
　　 (1)根據(jù)國內(nèi)外文獻，應用雞Ⅱ型膠原誘導DBA/1小鼠，建立膠原誘導的關節(jié)炎模型。
　　 (2)構建小鼠T-bet基因特異性的shRNA真核干擾載體和針對無意義序列的對照質(zhì)粒；通過將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC2.4細胞，分析其功能。
　　 (3)以表達T-be

2、t基因的真核質(zhì)粒及T-bet特異性真核干擾質(zhì)粒進行關節(jié)局部干預，觀察各組小鼠關節(jié)炎發(fā)病時間及成模小鼠的行為改變，并收集各組小鼠關節(jié)、脾臟和腹股溝淋巴結(jié)。
　　 (4)對病變關節(jié)行HE染色及免疫組化染色，觀察關節(jié)局部滑膜炎癥損傷程度及T-bet表達情況。
　　 (5)應用熒光定量PCR法，檢測病變關節(jié)滑膜、脾臟及淋巴結(jié)T-bet和相關炎癥因子的表達水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)成功建立了雞Ⅱ型膠原誘

3、導的小鼠關節(jié)炎模型，小鼠關節(jié)炎的發(fā)病率為100％，平均發(fā)病時間為35±5天，關節(jié)炎癥得分為10±2分。
　　 (2)成功構建了針對轉(zhuǎn)錄因子T-bet的特異性真核干擾質(zhì)粒及針對無意義序列的對照質(zhì)粒。通過對轉(zhuǎn)染有T-bet真核干擾質(zhì)粒的DC2.4細胞研究表明，與對照組相比，T-bet mRNA及蛋白的表達水平均明顯降低，同時DC2.4細胞表達IFN-γ水平亦明顯降低。經(jīng)流式細胞儀分析顯示，轉(zhuǎn)有真核干擾質(zhì)粒的DC2.4細胞，其表面CD

4、80、CD86和MHCⅡ類分子均呈現(xiàn)明顯下調(diào)。提示，本試驗構建的針對T-bet基因的真核干擾質(zhì)粒，能夠有效地抑制T-bet基因的表達，同時相關細胞因子和表面分子的表達水平也發(fā)生了相應的改變。
　　 (3)膠原誘導性小鼠關節(jié)炎模型鼠的關節(jié)局部干預研究表明，在T-bet質(zhì)粒干預小鼠，其關節(jié)局部可因T-bet基因的高表達而明顯促進關節(jié)炎的發(fā)生，發(fā)病率為100％，且發(fā)病時間提前，一般在誘模的第22天左右發(fā)病，平均發(fā)病時間為23±2天，關

5、節(jié)平均炎癥評分3.5±O.5分；在T-bet干擾質(zhì)粒干預的小鼠，其關節(jié)發(fā)病率僅為20％，平均發(fā)病時間延長為40±5天，炎癥評分1±0.5分。
　　 結(jié)論：
　　 T-bet是Th1細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在初始T細胞向Th1細胞的分化過程中發(fā)揮了極其重要的作用。本試驗構建了T-bet特異性真核干擾質(zhì)粒；經(jīng)轉(zhuǎn)染樹突狀細胞系表明，其對T-bet及其相關細胞因子的表達具有明顯的抑制作用；膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型局部應用的干預研究