髓樣抑制細(xì)胞在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠發(fā)病過程中的變化和作用研究.pdf

1、目的:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和軟骨破壞為特征的慢性、全身性自身免疫性疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)髓樣抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)在自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。本研究的目的是探討MDSC在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠發(fā)病過程中的動(dòng)態(tài)變化及作用，從而為類

2、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供新的思路。
　　方法:
　　(1)使用牛Ⅱ型膠原和佐劑建立DBA/1J小鼠CIA模型并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。免疫后第21天、28天、35天、40天和45天采用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)CIA小鼠及正常對(duì)照小鼠外周血、脾臟和骨髓CD11b+Gr-1+的MDSC比例動(dòng)態(tài)變化。
　　(2)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第35天CIA小鼠及正常對(duì)照小鼠脾臟MDSC表面CD40、CD80、CD86

3、、MHCⅡ和PD-L1分子的比例。
　　(3)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)第35天CIA小鼠及正常對(duì)照小鼠脾臟MDSC精氨酸酶1（arginase1，ARG-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)以及趨化因子受體CCR2、CCR5、CXCR2和CXCR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　(4)流式分選第35天CIA小鼠脾臟MDSC，磁珠分選正常小鼠淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞，并

4、且用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)標(biāo)記。MDSC與CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞以不同的比例(0∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8)共培養(yǎng)5天，加重組鼠IL-2和鼠T細(xì)胞活化CD3/CD28免疫磁珠刺激。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞增殖情況。
　　(5)流式分選第35天CIA小鼠脾臟MDSC，通過尾靜脈注射過繼轉(zhuǎn)移給初次

5、免疫后第14天的CIA小鼠，注射PBS作為對(duì)照。對(duì)小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。第45天處死小鼠，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H&E)染色分析小鼠關(guān)節(jié)組織病理變化，流式芯片檢測(cè)小鼠血漿細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)免疫后的CIA小鼠大多在第28天開始出現(xiàn)足爪紅腫，35天左右關(guān)節(jié)炎評(píng)分最高，然后緩慢降低。外周血CD11b+Gr-1+的MDSC比例在第35天、40天和45天高于正常對(duì)照小鼠(P＜0.

6、05)。CIA小鼠脾臟(P＜0.05)和骨髓（P＜0.01）中MDSC的比例在第21天、28天、35天、40天和45天均顯著高于正常對(duì)照小鼠。
　　(2)第35天CIA小鼠脾臟MDSC表面CD80、CD86和PDl-L1的表達(dá)水平高于正常對(duì)照小鼠(P＜0.05)，但MDSC表面CD40和MHCⅡ的表達(dá)水平二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　(3)第35天CIA小鼠脾臟MDSC ARG-1和CCR2 mRNA的表達(dá)水平高于

7、正常對(duì)照小鼠(P＜0.05)，CXCR2和CXCR4mRNA的相對(duì)表達(dá)水平低于正常對(duì)照小鼠(P＜0.05)，iNOS和CCR5的表達(dá)水平二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　(4)當(dāng)MDSC/CD4+T細(xì)胞從1∶1到1∶4共培養(yǎng)時(shí)均能顯著抑制CD4+T細(xì)胞增殖(P＜0.05)，當(dāng)MDSC/CD4+T細(xì)胞為1∶1和1∶2時(shí)抑制作用最明顯(P＜0.001)。當(dāng)MDSC/CD4+T細(xì)胞在1∶8共培養(yǎng)時(shí)，MDSC對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的抑

8、制作用不明顯(P＞0.05)。
　　(5)過繼轉(zhuǎn)移MDSC與注射PBS的CIA小鼠相比，發(fā)病延遲，關(guān)節(jié)炎評(píng)分降低。關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)滑膜炎癥、軟骨破壞和骨質(zhì)侵襲顯著減輕。過繼轉(zhuǎn)移MDSC的小鼠血漿促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-17的表達(dá)水平與對(duì)照小鼠相比降低(P＜0.05)，抑制炎癥的細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平升高（P＜0.05），IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:

9、
　　(1) CIA小鼠發(fā)病過程中MDSC的比例明顯增高，并且呈現(xiàn)與發(fā)病情況類似的動(dòng)態(tài)變化，提示MDSC可能在CIA小鼠病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
　　(2) CIA小鼠發(fā)病高峰期MDSC表面分子和功能分子的表達(dá)出現(xiàn)改變，這些分子可能與MDSC的免疫抑制功能相關(guān)。
　　(3) CIA小鼠MDSC抑制CD4+T細(xì)胞增殖，過繼轉(zhuǎn)移MDSC又能改善CIA小鼠的病情，提示MDSC在調(diào)節(jié)自身免疫性關(guān)節(jié)炎的過程中發(fā)揮重要作用，為細(xì)胞