戊四氮致癇后大鼠海馬中Caspase3和Hsp70的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化.pdf

1、目的:癲癇是以腦神經(jīng)元過(guò)度異常放電導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作性和短暫性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的一種腦功能失調(diào)綜合征,其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。
　　 癲癇可致腦損傷,細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡啟動(dòng)一系列復(fù)雜的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),是癲癇致腦損傷的一條重要途徑。長(zhǎng)時(shí)間癲癇反復(fù)發(fā)作后可出現(xiàn)腦內(nèi)選擇性的神經(jīng)元凋亡壞死和海馬硬化,一旦出現(xiàn)了海馬硬化,則腦組織損傷及記憶功能障礙將不可逆。通過(guò)腹腔注射戊四氮(pentylenetrazol,PTZ)建立癲癇持續(xù)

2、狀態(tài)大鼠模型來(lái)觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)改變,如采用Nissl染色法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞丟失壞死情況;Timm染色法觀察海馬組織苔蘚纖維出芽情況;電鏡觀察海馬CA3區(qū)的超微結(jié)構(gòu);同時(shí)運(yùn)用免疫組化法計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值;Western blot方法分別檢測(cè)海馬組織中caspase3和hsp70的表達(dá)情況。初步探討了癲癇發(fā)作后caspase3介導(dǎo)的凋亡相關(guān)途徑和Hsp70的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況,將有助于從分子水平上更有效的尋求癲癇的治療靶點(diǎn),及時(shí)進(jìn)行干

3、預(yù)并控制凋亡的發(fā)生,為減輕癲癇致腦損傷提供新方法。
　　 方法:選取清潔級(jí)(SPF級(jí))雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只,實(shí)驗(yàn)起始體重(180±20)g,12h光亮/黑暗條件、22℃-25℃環(huán)境溫度,分籠喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為癲癇持續(xù)狀態(tài)組(status epilepticus,SE組)和對(duì)照組(normal control group,NC組)兩個(gè)大組,SE組又分為癲癇發(fā)作后3h組、6h組、12h組、24h組,

4、5組各14只。SE各組大鼠應(yīng)用生理鹽水溶解的1％PTZ溶液,首先按40 mg/kg腹腔注射,10 min后再給20 mg/kg,根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)作情況再適量追加10 mg/kg,直至出現(xiàn)Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)發(fā)作為止。Racine將點(diǎn)燃分為六級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),至今仍在實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。0級(jí),無(wú)任何反應(yīng):Ⅰ級(jí),濕狗樣抖動(dòng),面部抽搐及咀嚼;Ⅱ級(jí),頸部肌肉痙攣,表現(xiàn)為點(diǎn)頭和/或甩尾;Ⅲ級(jí),一側(cè)前肢痙攣;Ⅳ級(jí),雙側(cè)前肢痙攣伴站立;Ⅴ級(jí),全身陣攣、失去平衡甚至跌倒。

5、完全點(diǎn)燃的標(biāo)準(zhǔn)是達(dá)到Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)發(fā)作且持續(xù)30min以上。對(duì)照組注射同等容量的生理鹽水。觀察大鼠行為學(xué)改變,后將各組大鼠隨機(jī)選取3只行Nissl染色和Timm染色法分別檢測(cè)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞丟失壞死情況和苔蘚纖維出芽情況,3只用于電鏡觀察海馬CA3區(qū)的超微結(jié)構(gòu),5只行免疫組化法計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值,3只用于Western blot法分別進(jìn)行檢測(cè)海馬組織中caspase3和hsp70的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因持續(xù)強(qiáng)直發(fā)作而抽搐死亡的大鼠應(yīng)

6、及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充(已補(bǔ)充28只)。
　　 結(jié)果:1動(dòng)物模型制備SE組有效應(yīng)用的大鼠70只,11只應(yīng)用40mg/kg、14只50mg/kg、15只60mg/kg、18只70mg/kg、8只80mg/kg、4只90mg/kg PTZ即開(kāi)始出現(xiàn)驚厥,主要表現(xiàn)為節(jié)律性點(diǎn)頭、肌陣攣。隨著PTZ每10min注射一次,很快出現(xiàn)四肢抽搐,進(jìn)入全面性強(qiáng)直發(fā)作致失去姿勢(shì)控制,前、后肢強(qiáng)烈收縮,并伴有呼吸抑制,口周發(fā)紫,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短不等。強(qiáng)直階段過(guò)后便出

7、現(xiàn)全面性強(qiáng)直一陣攣發(fā)作。NC組動(dòng)物均無(wú)行為學(xué)改變。
　　 2大鼠海馬組織學(xué)改變
　　 2.1 Nissl染色觀察 SE組可見(jiàn)神經(jīng)元皺縮體積縮小,胞核深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,多數(shù)胞漿呈空泡狀,海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列散亂,細(xì)胞密度小,尼氏體減少,部分神經(jīng)元丟失,24h組最明顯,3h腦損傷最輕;對(duì)照組海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,胞核淡染、胞漿染色清晰,CA1區(qū)細(xì)胞幾乎呈均勻一致的紫藍(lán)色,細(xì)胞密度大,尼氏體著藍(lán)色,形態(tài)

8、接近正常。
　　 2.2 Timm染色法觀察 SE各亞組和對(duì)照組的CA3區(qū)苔蘚纖維出芽評(píng)分僅0～1分。
　　 2.3海馬CA3區(qū)超微結(jié)構(gòu)觀察 SE組海馬CA3區(qū)可見(jiàn)神經(jīng)元核膜邊界不清、可有內(nèi)陷,染色質(zhì)有邊集,線粒體數(shù)量減少或有腫脹,24h組最明顯,3h組較輕:對(duì)照組神經(jīng)元核膜清晰,線粒體完整,細(xì)胞器基本完好。
　　 3腦組織中caspase3和hsp70表達(dá)情況 SE后3h caspase3和hsp70在海馬神經(jīng)

9、細(xì)胞胞漿中著色開(kāi)始增多,陽(yáng)性細(xì)胞率(P＜0.01與對(duì)照組比較),并隨時(shí)間延長(zhǎng)其陽(yáng)性細(xì)胞率相應(yīng)性升高,24h明顯增高(P＜0.01)。對(duì)照組可見(jiàn)caspase3和hsp70在海馬胞漿中呈現(xiàn)散在著色。
　　 4大鼠海馬中caspase3和hsp70的蛋白表達(dá) SE后3h caspase3和hsp70表達(dá)開(kāi)始增高(P＜0.05與對(duì)照組比較),24h明顯增高(P＜0.05)。對(duì)照組僅有少量的caspase3和hsp70表達(dá)。