米諾環(huán)素對戊四氮致癇大鼠海馬的保護(hù)作用.pdf

1、癲癇(epilpsy,EP)是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的以短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病。癲癇發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，其中有一部分是通過細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。其中NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性是神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制之一。谷氨酸是腦內(nèi)最主要的內(nèi)源性興奮性氨基酸。在癲癇、腦外傷與慢性退行性神經(jīng)疾病等病理過程中，谷氨酸通過激動其突觸后膜谷氨酸受體產(chǎn)生興奮性毒性，參與神經(jīng)元損害，以NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性為主。NMDA受體亦可介

2、導(dǎo)癲癇腦損傷病理中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化及產(chǎn)生損傷性物質(zhì)(如iNOS，ICE等)釋放。米諾環(huán)素(鹽酸二甲胺四環(huán)素，minoeyeline hydroehloride)為第二代人工半合成四環(huán)類抗生素，其抗菌譜與四環(huán)素相似。近年一些研究表明，在腦缺血、腦外傷、阿爾茨海默氏病和帕金森病及邊緣葉癲癇發(fā)作大鼠模型上，米諾環(huán)素均有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。由于米諾環(huán)素口服后迅速被吸收，脂溶性較高，組織穿透性好，且可以通過血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以更加引起

3、人們的重視。目前，已報道該類藥物神經(jīng)保護(hù)作用的一些機(jī)制，米諾環(huán)素在各種模型上均表現(xiàn)出了神經(jīng)保護(hù)作用，但其在全身性癲癇模型上對神經(jīng)元的保護(hù)作用，以及藥物劑量與神經(jīng)元的保護(hù)作用的關(guān)系尚未報道。在全身性癲癇模型中米諾環(huán)素能否拮抗NMDA受體，能否抑制NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性，其抑制NMDA受體的興奮性毒性是否通過直接環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，米諾環(huán)素能否減少凋亡的發(fā)生是本實驗關(guān)注的焦點。目的：用戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)制造

4、癲癇大鼠模型，用不同劑量的米諾環(huán)素進(jìn)行干預(yù)，檢測海馬區(qū)中細(xì)胞凋亡，海馬CA1、CA3區(qū)NMDA受體型亞單位(NR1)表達(dá)情況，進(jìn)一步探討不同劑量米諾環(huán)素對致癇大鼠神經(jīng)元的作用，米諾環(huán)素是否能直接拮抗NMDAR1。 方法： 1分組 采用完全隨機(jī)設(shè)計。將60只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)抽取8只作為正常組(normal)，其余52只用戊四氮制造癲癇模型，篩選造模合格大鼠32只隨機(jī)分為：戊四氮致

5、癇組(PTZ)和致癇后米諾環(huán)素每次20mg/kg干預(yù)組(MT1)、致癇后米諾環(huán)素每次45mg/kg干預(yù)組(MT2)、致癇后米諾環(huán)素每次90mg/kg干預(yù)組(MT3)。 2造模 正常組腹腔注射生理鹽水，致癇大鼠按45mg/kg腹腔注射PTZ溶液，每次注射間隔48小時，直到點燃(出現(xiàn)RacineV級)。 3給藥 各米諾環(huán)素干預(yù)組于癲癇終止后30分鐘內(nèi)給予米諾環(huán)素灌胃。MT1組首劑給予40mg/kg，以后每12

6、小時給予20mg/kg。MT2組首劑給予90mg/kg，以后每12小時給予45mg/kg。MT3組首劑給予180mg/kg，以后每12小時給予90mg/kg。PTZ組和正常組給予蒸餾水灌胃。共灌胃5天。 4腦電圖 將大鼠麻醉后固定于固定架上，采用頭皮針狀電極單極導(dǎo)聯(lián)法，于大鼠頂骨正中左右兩側(cè)頭皮下處留置針灸針，待大鼠清醒后制作模型，觀察癇性放電的頻率及其振幅變化。 5免疫組織化學(xué)染色麻醉狀態(tài)下經(jīng)左心室行主動脈插管

7、，4％多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注，取腦固定，常規(guī)包埋，標(biāo)本冠狀位石蠟切片。經(jīng)過抗原修復(fù)、小牛血清封閉后，加NMDAR1抗體，在經(jīng)二抗、三抗孵育，DAB顯色后置顯微鏡下觀察記錄。 6原位末端標(biāo)記DAN片段灌注，固定，常規(guī)包埋，切片同上。經(jīng)脫蠟、蛋白酶消化后，加入TUNEL反應(yīng)液，滴加復(fù)合液，DAB顯色，置鏡下觀察。 結(jié)果： 1癲癇行為學(xué) 造模大鼠均出現(xiàn)不同程度的癇性發(fā)作，造模成功。 2腦電圖 致癇

8、大鼠腦電圖出現(xiàn)陣發(fā)尖波。正常對照組大鼠腦電無異常。 3免疫組織化學(xué)結(jié)果正常組與其它各組之間比較，正常組NMDAR1光密度值最低都具有顯著性差異(P<0.05)。戊四氮模型(PTZ)組與米諾環(huán)素各干預(yù)組之間比較，光密度值無顯著性差異(P>0.05)。米諾環(huán)素各干預(yù)組之間光密度值無顯著性差異(P>0.05)。光鏡下觀察，免疫組織化學(xué)染色后，正常組NMDAR1陽性細(xì)胞在大腦皮質(zhì)各層內(nèi)彌散分布，在海馬主要分布于錐體細(xì)胞層及顆粒細(xì)胞層。其

9、它各組與正常組相比，大腦皮層及海馬NMDAR1免疫反應(yīng)染色明顯加深，數(shù)目增多。 4檢測TLJNEL結(jié)果PTZ組與MT1組比較，細(xì)胞凋亡數(shù)目無顯著性差異(P>0.05)：PTZ組與MT2組比較，MT2細(xì)胞凋亡數(shù)少，具有顯著性差異(P<0.05)；PTZ組MT3組比較，MT3組細(xì)胞凋亡多，具有顯著性差異(P<0.05)；各干預(yù)組之間比較，MT2組細(xì)胞凋亡較MT1組、MT3組都少，有顯著性差異(P<0.05)。MT1與MT3組比較，MT1細(xì)胞

10、凋亡數(shù)少，有顯著性差異(P<0.05)。正常組與其它各組比較，Normal組細(xì)胞凋亡數(shù)目少，有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1米諾環(huán)素每次45mg/kg能減少戊四氮致癇大鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡。米諾環(huán)素每次90mg/kg不能減少致癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，反而加強(qiáng)大鼠腦神經(jīng)元凋亡。米諾環(huán)素對海馬神經(jīng)元的作用具有雙向性。 2米諾環(huán)素不能減少NMDAR1的陽性表達(dá)，可能其不能直接拮抗NMDAR1。其抑制NMDA受