氯喹干預戊四氮致癇作用的研究.pdf

1、癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病之一，對該病如何有效地防治是當今神經(jīng)領域研究的一個熱點。由于癲癇發(fā)生機制復雜，長期以來對其防治的研究未取得突破性進展。我們以前的研究結果和文獻報告均證實，在癲癇發(fā)生發(fā)展的過程中，存在神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等因素的異常和相互調(diào)節(jié)的紊亂，由此首次提出了“神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡失衡與癲癇發(fā)生有關”的學說，并認為以神經(jīng)因素為主，免疫和內(nèi)分泌因素在受體、信使和基因表達水平發(fā)揮調(diào)控作用，為癲癇的綜合防治

2、開拓了一條新的路徑。因此，有效調(diào)控神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡的平衡，對癲癇發(fā)生和復發(fā)的防治具有重要意義。 氯喹為一種傳統(tǒng)的抗瘧疾藥。新近的研究證實其藥理作用非常廣泛，如通過與DNA結合抑制細胞的分裂增殖、抑制人單核巨噬細胞系統(tǒng)細胞因子的合成與分泌、抑制蛋白質(zhì)的合成及一些酶的活性、與CaM結合后影響鈣調(diào)蛋白及其效應酶活性等。另由于其影響進入DNA復制途徑和基因表達途徑中的一些酶的活性，從而影響DNA的復制和基因的轉錄?；谏鲜鏊幚碜饔?/p>

3、，氯喹已被用于幾種與免疫及增生有關疾病的防治(如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)，并取得了令人滿意的結果，有些尚在臨床評估過程中(如AIDS)。 本論文共分6個部分，第1～5部分的實驗設計和實驗結果如下： 實驗用SD雄性大鼠48只，隨機分為對照組(12只)、PTZ致癇組(18只)和氯喹干預組(18只)。PTZ致癇組經(jīng)腹腔注射PTZ(60mg/kg)致癇，氯喹干預組預先在側腦室注射氯喹6μl(0.61mg/kg)，2h后

4、腹腔注射PTZ致癇，對照組側腦室注射生理鹽水6μl。然后觀察記錄3組大鼠的行為表現(xiàn)，參照Smialowski的評估標準分為6級，并在注射后2h內(nèi)分別記錄大腦皮質(zhì)和海馬的腦電變化。4％的多聚甲醛灌注，恒冷箱(-20℃)切片機作額狀切片，用免疫組化做膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、增殖細胞核抗原(proliferationcellnucleusantigen,PCNA)、Glu、NR

5、1、IL-1β、TNF-α、ER、PR和CaMKⅡ標記；Westernblotting檢測皮質(zhì)和海馬CyclinD1、NR1、TNF-α、ER和CaMKⅡ的含量。結果用圖像分析系統(tǒng)作半定量分析。 結果顯示：(1)行為表現(xiàn)：對照組無癇樣發(fā)作，PTZ致癇組癇樣發(fā)作重(Ⅳ～Ⅴ)，氯喹干預組發(fā)作輕(多在Ⅰ～Ⅲ級)(P＜0.01)；(2)腦電記錄：對照組無癇樣放電，PTZ致癇組呈典型的癇樣波，氯喹干預組表現(xiàn)為慢波和小棘波；(3)GFAP、

6、PCNA和CyclinD1在PTZ致癇組的星形膠質(zhì)細胞表達明顯增強，氯喹干預組無明顯增強趨勢(P＜0.05)；(4)Glu和NR1在PTZ致癇組表達明顯增強，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，氯喹干預組無明顯增強；(5)IL-1β和TNF-α在PTZ致癇組腦內(nèi)表達明顯增加，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，氯喹干預組無明顯變化(P＞0.05)；(6)ER在PTZ致癇組腦內(nèi)表達明顯增強，PR表達明顯降低，與對照組比較差異有

7、顯著性(P＜0.05)，兩者在氯喹干預組與對照組的比較無明顯變化(P＜0.05)；(7)CaMKⅡ在PTZ致癇組、氯喹干預組和對照組腦內(nèi)的表達未見明顯差異(P＞0.05)。 根據(jù)對上述實驗結果的分析，初步得出如下結論：(1)氯喹抑制PTZ致癇大鼠的癇樣發(fā)作和癇樣放電；(2)氯喹對膠質(zhì)細胞增殖活性有抑制作用；(3)氯喹通過不同途徑、多個環(huán)節(jié)對Glu、NR1信號傳導通路的激活進行干預，從而影響癲癇的發(fā)生和發(fā)展；(4)氯喹抑制腦內(nèi)IL

8、-1β和TNF-α的合成與分泌；(5)氯喹通過對雌激素合成過程中P450芳香化酶活性的抑制而減少雌激素的合成，增加孕激素的產(chǎn)生，從而降低雌激素-ER信號傳導通路的活性，增強孕激素-PR信號傳導通路的活性，抑制由性激素介導的癇樣發(fā)作。(6)氯喹通過對CaMKⅡ活性的干預發(fā)揮抑癇作用。 氯喹抑癇的機制可能是通過：(1)氯喹與DNA二級結構結合，干擾了DNA的復制；(2)其能升高溶酶體和高爾基器網(wǎng)泡內(nèi)的pH值，抑制一些酶的活性，包括酸

9、性水解酶、蛋白質(zhì)修飾酶等，從而影響翻譯后新合成蛋白質(zhì)的修飾；(3)氯喹通過升高核內(nèi)體內(nèi)的pH值，干擾Fe2+從轉鐵蛋白的解離，導致細胞內(nèi)鐵的濃度降低，影響進入DNA復制途徑和基因表達途徑中幾種酶的活性，從而影響DNA的復制和基因的表達；(4)氯喹與CaM之間通過縮水作用和靜電作用而結合，影響鈣調(diào)蛋白及其效應酶的活性，細胞Ca2+內(nèi)流減少，降低組織的興奮性，抑制癇樣發(fā)作和癇樣放電；(5)氯喹通過抑制IL-1β和TNF-α的合成與分泌，降低

10、了免疫因素在癲癇發(fā)病中的作用而發(fā)揮抑癇作用；(6)氯喹通過抑制雌激素代謝過程中P450芳香化酶的活性，影響由雌、孕激素介導的腦的興奮性。 綜上所述，我們認為氯喹可能通過對神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等因素的調(diào)控，發(fā)揮其抑癇作用，這些作用可能在綜合防治癲癇的發(fā)生發(fā)展和復發(fā)及癲癇發(fā)病機制的闡明方面具有重要的理論和臨床實用價值。 第6部分：研究星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，Ast)與神經(jīng)元之問信號交流的分子機制。用馬桑內(nèi)酯(cori

11、arialactone，CL)激活的星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(astrocytecontinedmedium，ACM)對大鼠腦內(nèi)Glu及其GluR2表達的影響作了觀察。把培養(yǎng)的AstACM分為對照組(不加任何刺激因素)和CL激活組(2.5×10-5mol/L)，激活2h后收集培養(yǎng)液，然后用于在體側腦室注射實驗。40只成年健康雄性SD大鼠，隨機分為對照組(8只，注射未加刺激物的ACM10μl)和CL組(注射CL激活的ACM10μl)，按注射

12、后的時間分為2h、4h、8h和12h(每個時間點8只)。然后觀察兩組大鼠的行為表現(xiàn)，用免疫組化和免疫熒光檢測腦內(nèi)Glu和GluR2表達的變化，Westernblotting檢測腦內(nèi)GluR2含量的變化。結果顯示，側腦室注射CL激活的ACM的大鼠有癇樣發(fā)作，而對照組無癇樣發(fā)作；免疫組化和免疫熒光檢測結果顯示，Glu在注射CL激活的ACM組的皮質(zhì)和海馬表達較對照組增強(P＜0.05)，而GluR2在皮質(zhì)和海馬表達較對照組減弱(P＜0.05)