AcMNPV敏感宿主Spodoptera frugiperda若干免疫及表觀遺傳相關(guān)基因的研究.pdf

1、桿狀病毒科的成員是一類在自然界中僅感染節(jié)肢動物的雙鏈DNA病毒。其中苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multicapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV)為桿狀病毒的模式種。由于桿狀病毒對宿主昆蟲具有高度的致病性，對非靶標生物沒有感染性，生物安全性高，不污染環(huán)境，害蟲不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，世界上已有數(shù)十種桿狀病毒成功用于防治農(nóng)、林、牧業(yè)等相關(guān)害蟲。然而桿狀病毒作為生物殺蟲劑

2、也存在一些缺點，限制了它們的進一步推廣和應用。安全、有效地應用桿狀病毒取決于對病毒的生物學、與宿主的相互作用的深入認識。自從1994年AcMNPV全基因組測序工作完成以來，已經(jīng)有很多必需基因的功能被闡釋，然而對其與宿主相互作用之間關(guān)系的研究大多仍停留在分子生物學水平階段。桿狀病毒在長期進化過程中與其昆蟲宿主建立了嚴格的寄生關(guān)系，兩者間相互作用、相互適應，這種作用是發(fā)生在多層次、多水平上的。我們設想從免疫學和表觀遺傳學這兩部分入手，探尋T

3、oll信號通路、DNA甲基化和microRNA三個方面在病毒與宿主之間相互關(guān)系中所起的作用。
　　Toll蛋白最早發(fā)現(xiàn)參與果蠅背腹極性的形成，后來發(fā)現(xiàn)Toll信號通路也可以被微生物感染所激活，參與天然免疫應答。為了AcMNPV的宿主昆蟲草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中探尋Toll信號通路，我們分別克隆了編碼Toll的同源蛋白18-wheeler、Toll的體外接頭蛋白Sp(a)tzle以及Toll的胞內(nèi)配

4、體MyD88的基因。18-wheeler編碼一個1274個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白與家蠶和果蠅中的同源類似物的相似度分別達56％和44％。Sp(a)tzle是一個編碼253個氨基酸的蛋白，與煙草天蛾中的兩個同源蛋白相似度分別為50％和52％。通過蛋白序列比對分析發(fā)現(xiàn)在Sp(a)tzle無活性的前體中也有一個非常保守的蛋白酶切位點，可以通過該位點被切割形成有活性的成熟體?？寺〉玫降腗yD88經(jīng)過結(jié)構(gòu)域的預測分析發(fā)現(xiàn)和該家族其他成員一樣，都含

5、有一個死亡結(jié)構(gòu)域和一個TIR結(jié)構(gòu)域。這些信息說明S.frugpiperda中的Toll信號通路的關(guān)鍵蛋白都具有一定的保守性，推測它們應該有著非常重要的功能。這些基因在AcMNPV的敏感細胞系Sf9細胞中都得到了表達。我們在斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)用各種不同的微生物或其代表分子刺激后發(fā)現(xiàn)，18-wheeler和Sp(a)tzle可以特異性地被金黃色葡萄球菌激活，在脂肪體和中腸內(nèi)都有表達。同時，被激活的還有一種證明有抗AcMNPV病毒活性的抗菌肽G

6、loverin。當我們提取被金黃色葡萄球菌免疫刺激后的斜紋夜蛾幼蟲血淋巴孵育Sf9也觀察到了同樣的效果。然而當我們試圖在Sf9細胞中過表達這三個蛋白的任何一種或者兩兩組合來模擬天然感染狀態(tài)時，卻沒有觀測到Gloverin的提高，因此推測Sf9細胞作為非免疫組織來源細胞在長期的離體培養(yǎng)過程中失去了一定的免疫功能導致Toll信號通路不能被激活，所以也無法誘導Gloverin表達的升高，為AcMNPV的入侵和復制創(chuàng)造了有利的條件。
　　

7、DNA甲基化是一個非常重要的表觀遺傳學現(xiàn)象，它在高等真核生物中被認為是沉默基因表達的重要調(diào)控工具之一。這種修飾是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)完成的。真核生物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要有三類:DNMT1、DNMT2、DNMT3。其中DNMT2家族有著非常保守的序列特征然而對于其功能卻不甚明了。前期研究表明，AcMNPV在復制過程中，病毒DNA的甲基化水平呈一定的規(guī)律性變化，而其中的機制及其與病毒復制的關(guān)系還不清楚。為了深入探討這一問題，我們

8、從Sf9細胞中克隆出了編碼DNMT2的基因。該酶與其他家族成員一樣有著非常保守的序列，它均勻分布在細胞核和細胞質(zhì)中，體外酶活實驗證明它有能催化DNA甲基化。我們還解析出了DNMT2與其輔酶SAH的晶體結(jié)構(gòu)，和人DNMT2的結(jié)構(gòu)一樣，它包含一個催化區(qū)、一個底物識別結(jié)構(gòu)域和一個催化環(huán)。結(jié)合的SAH與周圍的氨基酸有非常強烈的相互作用，催化環(huán)和底物識別區(qū)域一起形成一個狹長的通往SAH結(jié)合位點的通道，可以用來結(jié)合和催化底物。這些結(jié)果暗示在昆蟲中D

9、NMT2也是以經(jīng)典的甲基化酶催化模式來甲基化底物，這為我們在Sf9中探尋DNMT2的功能提供了線索。此外我們還在Sf9細胞中克隆出了編碼DNMT1的基因，它也與其他物種中的同源蛋白有很高的相似度，與家蠶DNMT1的相似度為83％、與黑脈金斑碟的DNMT1高達74％、與蜜蜂的DNMT1相似度為50％，與人的DNMT1也有49％的相似度。結(jié)構(gòu)域分析表明除了甲基化酶催化區(qū)以外，DNMT1在其N端區(qū)，包括復制叉識別結(jié)構(gòu)域(RFD)、CXXC結(jié)構(gòu)

10、域和兩個BAH結(jié)構(gòu)域。DNMT1在病毒感染中所起的作用還在進一步的研究中。
　　最后，我們用AcMNPV感染6小時和12小時的Sf9細胞連同未感染的細胞為對照樣本，進行了細胞小RNA的深度測序。我們嘗試尋找在AcMNPV這種快速裂解性的病毒中是否存在microRNA的調(diào)控，或者細胞針對病毒感染有沒有產(chǎn)生microRNA進行主動防御。分析測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了30個AcMNPV來源的可能編碼microRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體序列，再根據(jù)成熟

11、體microRNA可能定位于5'或3'前體莖環(huán)臂上，一共預測出60個成熟體，對測到的讀值都進行了統(tǒng)計分析。這些病毒來源的microRNA都是全新的，說明病毒編碼的microRNA的保守性相對比較差。同樣我們也測到很多宿主來源的microRNA，這些microRNA中有一部分是新的，另一部分是在已知數(shù)據(jù)庫中可以找到保守序列的。針對這些microRNA做表達差異分析，發(fā)現(xiàn)大部分都是針對病毒感染的不同時間點有相應地提高。目前對病毒編碼和宿主來