細(xì)粒棘球蚴重組抗原14-3-3和蘋果酸脫氫酶誘導(dǎo)宿主DC-CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過比較不同免疫保護(hù)力的細(xì)粒棘球蚴重組抗原14-3-3（rEg14-3-3）和線粒體蘋果酸脫氫酶（rEgmMDH）對宿主樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的成熟、DC細(xì)胞遞呈并促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化、分化及效應(yīng)的影響，研究細(xì)粒棘球蚴抗原所誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答機(jī)制。
　　方法：1.抗原的獲?。孩僦亟M抗原的表達(dá)：通過原核表達(dá)以及親和層析純化獲得細(xì)粒棘球蚴重組抗原rEg14-3-3和rEgmMDH，并復(fù)性獲取可溶性蛋白

2、rEgmMDH；②天然粗抗原的制備：外科手術(shù)剝離細(xì)粒棘球蚴病人的包囊并無菌收集囊液和分離原頭蚴，原頭蚴經(jīng)液氮研磨和超聲破碎獲取可溶性抗原。
　　2.小鼠骨髓來源的DC（BMDC）的制備和培養(yǎng)：無菌分離小鼠骨髓細(xì)胞，通過GM-CSF、IL-4定向培養(yǎng)7天，獲取未成熟DC。
　　3.不同抗原刺激BMDC的掃描電鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測：LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原頭蚴粗抗原和囊液分別刺激未成熟BMDC48小時，掃描電

3、鏡觀察各組BMDC表面形態(tài)特征，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組 BMDC的表面分子（MHCⅡ、CD40、CD80和CD86）和極化因子（IL-12和CCL2）的表達(dá)水平。
　　4.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）及流式細(xì)胞術(shù)檢測：無菌分離正常小鼠脾臟單個淋巴細(xì)胞，通過磁珠分選分離純化小鼠脾臟初始CD4+T細(xì)胞。LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原頭蚴粗抗原和囊液刺激培養(yǎng)的BMDC分別與初始CD4+T細(xì)胞按1:5的比例混合培養(yǎng)5天。流式細(xì)胞

4、術(shù)檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）后Th1，Th2，Th17和Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：1.獲得高純度的可溶性重組抗原rEg14-3-3和rEgmMDH，以及無菌的囊液抗原和原頭蚴可溶性抗原。
　　2.①掃描電鏡觀察結(jié)果顯示LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、SPA和HF抗原刺激的DC細(xì)胞均有部分分化為具有樹突狀突起的DC。②流式細(xì)胞術(shù)檢測各組抗原刺激BMDC的結(jié)果顯示，與PBS相比，相應(yīng)濃度的L

5、PS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原頭蚴可溶性抗原和囊液均能刺激BMDC高表達(dá)MHCⅡ類分子和CD40（P＜0.05）。與PBS相比，BMDC在相應(yīng)濃度的LPS、rEg14-3-3、原頭蚴可溶性抗原刺激后，可高表達(dá)CD80和CD86（P＜0.05），而相應(yīng)濃度的rEgmMDH刺激的BMDC低表達(dá)CD80（P＞0.05），相應(yīng)濃度的囊液刺激的BMDC低表達(dá)CD86（P＞0.05）。③比較分析rEg14-3-3組和rEgmMDH組

6、BMDC表面分子的表達(dá)水平，經(jīng)抗原rEg14-3-3刺激后的BMDC較高水平表達(dá)MHCⅡ類分子、CD80和CD86（P＜0.05）。④相應(yīng)濃度的LPS和rEgmMDH能刺激DC表達(dá)較高水平的極化因子IL-12（P＜0.05），相應(yīng)濃度的rEg14-3-3和囊液能刺激DC表達(dá)較高水平的極化因子CCL2（P＜0.05）。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)分析混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)后的CD4+T細(xì)胞，結(jié)果顯示，①與PBS相比，LPS、rEg14-3-3和r

7、EgmMDH能誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化較高水平的CD3+CD4+IFN-γ+T細(xì)胞（P＜0.05），而且比較rEg14-3-3和rEgmMDH組CD3+CD4+IFN-γ+T細(xì)胞的分化水平，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；② rEg14-3-3、囊液抗原能誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化較高水平的CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞（P＜0.05）；③rEgmMDH能誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞顯著分化高水平的CD3+CD4+IL-17+T細(xì)胞（P＜0

8、.05）；④LPS、rEgmMDH、原頭蚴可溶性抗原能誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化較高水平的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.與未獲得免疫保護(hù)力的抗原rEgmMDH相比，抗原rEg14-3-3更容易誘導(dǎo)DC成熟。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)顯示rEg14-3-3負(fù)載DC后優(yōu)勢誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞活化為高水平的Th1、Th2細(xì)胞亞群，rEgmMDH負(fù)載 DC后優(yōu)勢誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞活化為高水