促炎癥消退介質(zhì)脂氧素對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分 脂氧素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及活性氧產(chǎn)生的影響及機(jī)制
　　 目的：研究脂氧素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及活性氧產(chǎn)生的影響并探討其可能機(jī)制。
　　 方法：小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞，隨機(jī)分為6組：①對(duì)照組；②單純lipopolysaccharide (LPS)組：以終濃度2-10 μg/ml LPS 刺激巨噬細(xì)胞；③單純Thapsigargin(鈣池操縱的鈣通道激活劑)

2、組：以終濃度2 μM Thapsigargin刺激巨噬細(xì)胞；④脂氧素++LPS組：分別用終濃度為10-7、10-8或10-9M的脂氧素預(yù)處理，再以LPS(2-10 μg/ml)刺激；⑤脂氧素+Thapsigargin組：分別用終濃度為10-7、10-8或10-9M的脂氧素預(yù)處理，再以2 μM Thapsigargin 刺激；⑥2-Aminoethoxydiphenylborate(2-APB，鈣池操縱的鈣通道阻滯劑)+Thapsigar

3、gin組：20 μM 2-APB 預(yù)處理，再以2 μM Thapsigargin 刺激。采用細(xì)胞內(nèi)鈣離子特異性熒光探針Fluo3-AM和活性氧特異性熒光探針DCFH-DA 標(biāo)記小鼠巨噬細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察脂多糖引起巨噬細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣濃度變化，流式細(xì)胞儀測(cè)定巨噬細(xì)胞活性氧產(chǎn)生變化。
　　 結(jié)果：脂多糖呈劑量依賴升高細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度和活性氧的產(chǎn)生，鈣池操縱的鈣通道激活劑Thapsigargin 可完全抑制脂多糖引起的胞內(nèi)鈣

4、超載。脂氧素呈劑量依賴抑制脂多糖引起的胞內(nèi)游離鈣濃度升高，脂氧素同時(shí)可抑制Thapsigargin 激活鈣池操縱的鈣通道引起的鈣內(nèi)流。細(xì)胞外無(wú)鈣液及脂氧素均可抑制脂多糖和Thapsigargin 誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生。結(jié)論脂多糖通過(guò)促進(jìn)內(nèi)鈣釋放而開(kāi)放鈣池操縱的鈣通道，大量細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞使鈣超載，活性氧大量產(chǎn)生，引起組織細(xì)胞損傷。脂氧素可能通過(guò)抑制鈣池操縱的鈣通道，使外鈣內(nèi)流減少，保持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，減少活性氧的生成而起到抗炎促炎癥消退作用

5、。目的研究脂氧素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞TNF-α轉(zhuǎn)化酶表達(dá)的影響。方法小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組；②單純LPS組：以終濃度1-2 μg/ml LPS 刺激巨噬細(xì)胞；③脂氧素++LPS組：分別用終濃度為10-7、10-8或 10-9M的脂氧素預(yù)處理，再以LPS(1-2 μg/ml)刺激。孵育6小時(shí)和24小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液，酶聯(lián)免疫法測(cè)定上清液TNF-α濃度。提取細(xì)胞總mRNA,RT-P

6、CR測(cè)定TNF-α轉(zhuǎn)化酶和TNF-α基因表達(dá)，提取細(xì)胞總蛋白測(cè)定TNF-α轉(zhuǎn)化酶蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜型TNF-α蛋白表達(dá)。結(jié)果脂氧素抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α基因和膜型TNF-α蛋白表達(dá)。脂氧素抑制脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α轉(zhuǎn)化酶蛋白表達(dá)但不影響其mRNA 表達(dá)，并呈劑量依賴抑制脂多糖誘導(dǎo)的分泌型TNF-α產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：脂氧素通過(guò)干擾TNF-α轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，進(jìn)而減少脂多糖誘導(dǎo)的RAW2

7、64.7 巨噬細(xì)胞分泌型TNF-α的產(chǎn)生，這可能是脂氧素抗炎促炎癥消退的重要作用機(jī)制之一。
　　 第二部分 脂氧素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α 轉(zhuǎn)化酶的影響
　　 目的：研究脂氧素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的影響并探討其可能機(jī)制。
　　 方法：36 只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為6組(n =6)：①對(duì)照組：小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min，60 min 后尾靜脈注射10[％]乙醇5 ml/k

8、g；②脂氧素組：小鼠霧化吸入 0.9[％]生理鹽水20 min，60 min 后尾靜脈注射脂氧素(0.1 mg/kg)；③ ZnPP組：小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min，60 min 后尾靜脈注射Zinc protoporphyrinIX(血紅素氧合酶-1 抑制劑)25 mg/kg；④ LPS組：小鼠霧化吸入LPS 20 min，60 min后尾靜脈注射10[％]乙醇 5 ml//kg；⑤脂氧素治療組：以脂氧素0.1 mg/

9、kg 代替乙醇，其余處理同LPS組；⑥ ZnPP＋＋脂氧素治療組：處理同脂氧素治療組，但靜脈注射脂氧素30 min前注射ZnPP 25 mg/kg。霧化吸入LPS 或生理鹽水后8 h處死動(dòng)物。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，測(cè)定肺泡灌洗液白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和TNF-α含量及總蛋白濃度；測(cè)定肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性、干濕重比值、丙二醛(MDA)活性和一氧化氮(NO)濃度；測(cè)定肺組織血紅素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表達(dá)和活性。

10、r>　　 結(jié)果：與 LPS組比較，脂氧素治療組肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少、肺水腫減輕，肺組織MPO 活性、MDA 活性、NO 含量、TNF-α濃度均降低(P＜0.01)，肺泡灌洗液總蛋白濃度降低(P＜0.01)。而HO-1的蛋白表達(dá)和活性明顯升高，HO-1 抑制劑ZnPP 減弱脂氧素保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：脂氧素通過(guò)上調(diào)HO-1 減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。
　　 第三部分脂氧素對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制<

11、br>　　 目的：研究脂氧素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的影響并探討其可能機(jī)制。
　　 方法：36只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為6組((n=6):①對(duì)照組:小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20min，60min后尾靜脈注射10[％]乙醇5 ml/kg;②脂氧素組:小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min，60 min后尾靜脈注射脂氧素(0.1 mg/kg);③ZnPP組:小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min,60

12、min后尾靜脈注射血紅素氧合酶-1抑制劑25 mg/kg;④LPS組:小鼠霧化吸入LPS 20min，60min后尾靜脈注射10[％]乙醇5 ml/kg;⑤脂氧素治療組:以脂氧素0.1 mg/kg代替乙醇，其余處理同LPS組:⑥ZnPP+脂氧素治療組:處理同脂氧素治療組，但靜脈注射脂氧素30 min前注射ZnPP 25 mg/kg。霧化吸入LPS或生理鹽水后8h處死動(dòng)物。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，測(cè)定肺泡灌洗液白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和

13、TNF-α含量及總蛋白濃度:測(cè)定肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性、干濕重比值、丙二醛(MDA)活性和一氧化氮(NO)濃度:測(cè)定肺組織血紅素氧合酶-1的蛋白表達(dá)和活性。
　　 結(jié)果：與LPS組比較，脂氧素治療組肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少、肺水腫減輕，肺組織MPO活性、MDA活性、NO含量、TNF-。濃度均降低(P＜0.01)，肺泡灌洗液總蛋白濃度降低(P<0.01)。而HO-1的蛋白表達(dá)和活性明顯升高，HO-1抑制劑ZnPP減弱脂氧