2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、花粉與柱頭間的信號(hào)識(shí)別與傳遞,是植物進(jìn)行受精作用的前提條件。植物自交不親和性(Self- incompatibility,SI)是指雌蕊對自己和異己花粉進(jìn)行識(shí)別,通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞與級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終抑制自己花粉的生長,阻礙受精作用的過程。SI 是植物采取的一種促進(jìn)異交、避免自交的策略。對植物SI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究,不僅在植物生殖生物學(xué)上具有重要的意義,而且在育種上也具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。本文以羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var

2、.acephala)為實(shí)驗(yàn)材料,對SI進(jìn)行了如下方面的研究: 1. 羽衣甘藍(lán)S<,13b>單倍型純合體的鑒定以羽衣甘藍(lán)‘赤兔’和‘白波’兩個(gè)品種為實(shí)驗(yàn)材料,利用親和指數(shù)法經(jīng)過3代的自交選育,獲得了 9 號(hào)自交不親和系和 14 號(hào)自交親和系。利用 SRK 特異性引物 PK1 和PK4,采用 PCR 方法分別從花期柱頭和葉片中分離出9號(hào)自交不親和系SRK的cDNA和DNA序列。經(jīng)過 Blastn 分析表明,獲得的序列與甘藍(lán)SRK<,

3、13b>序列完全一致,因此認(rèn)為9號(hào)自交不親和系含有S<,13b>單倍型。通過對9號(hào)自交不親和系、9號(hào)自交后代、9號(hào)×14號(hào)雜交F<,1>代及14號(hào)自交親和系進(jìn)行了SRK的PCR-RFLP和Southern雜交分析,鑒定出9號(hào)自交不親和系是S<,13b>單倍型純合體。 2.分離羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系花粉中的SCR<,13b>利用SCR基因保守的信號(hào)肽編碼區(qū)設(shè)計(jì) SCR 特異性引物1和錨定 oligo(dT

4、)<,18>引物,采用RF-PCR方法從羽衣甘藍(lán)蕾期花藥中分離SCR<,13b>的cDNA片段。經(jīng)過Blastn分析表明,羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>與甘藍(lán)SCR<,13>序列具有高度的同源性,差異僅在于3個(gè)核苷酸(AAG)的插入和3個(gè)核苷酸(TT和C)的缺失。然后,利用甘藍(lán)SCR<,13>的5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)SCR<,13b>的特異性引物,獲得了羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>編碼區(qū)序列。SCR<,13b>編碼78個(gè)氨基酸,其氨基

5、酸序列與甘藍(lán)SCR<,13>有98.3%的序列一致性。SCR<,13b>基因DNA序列中含有一個(gè)758 bp的內(nèi)含子,內(nèi)含子的5’供體位點(diǎn)和3’受體位點(diǎn)邊界序列分別是5’-GU和3’-AG,符合內(nèi)含子邊界序列的GU-AG規(guī)則。 將分離的羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>成熟肽編碼區(qū)插入到pGEX-KG、pET-32a 原核表達(dá)載體中,構(gòu)建 pGEX-KG-SCR<,13b>和pET-32a-SCR<,13b>表達(dá)質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)化到 DH5

6、α、BL21(DE3)pLysS表達(dá)菌株中,通過蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化,獲得GST-SCR<,13b>和His-SCR<,13b>融合蛋白。利用生物授粉分析的方法,將GST-SCR<,13b>及His-SCR<,13b>融合蛋白涂抹在羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系柱頭乳突細(xì)胞上,然后進(jìn)行與14號(hào)自交親和系的雜交授粉,結(jié)果發(fā)現(xiàn)S<,13b>S<,13b>柱頭乳突細(xì)胞產(chǎn)生了SI反應(yīng),抑制了14號(hào)花粉的生長。這說明羽衣甘藍(lán)SCR

7、<,13b>是花粉中SI的信號(hào)分子,引起了SI反應(yīng)從而干擾了雜交親和授粉。 S<,13b>單倍型與S<,13b>單倍型具有相同的SI識(shí)別特異性,但SCR<,13b>與SCR<,13b>具有不同的核酸序列。本研究分離出的羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>,其氨基酸序列不同于甘藍(lán)SCR<,13b>,但具有較高的一致性。羽衣甘藍(lán)SCR<,13b>與其它的SCR氨基酸序列比對時(shí)發(fā)現(xiàn),有7個(gè)半胱氨酸殘基在SCR成熟肽內(nèi)是保守的。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

8、,SCR的聚類足根據(jù)SI強(qiáng)弱性質(zhì)而劃分的,而不是根據(jù)物種進(jìn)行聚類的。 3.分離鑒定羽衣甘藍(lán)SI信號(hào)傳遞因子BoARC1利用油菜BnARC1的序列設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR方法從花期柱頭中分離出羽衣甘藍(lán)BoARC1。它編碼一個(gè)663個(gè)氨基酸,分了量約為73 kDa的蛋白質(zhì)。在氨基酸序列比對中,BoARC1與BnARC1具有94%的一致性。Southern雜交顯示,BoARC1在羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系基因組

9、中只存在單一拷貝。Northern雜交分析表明,BoARC1特異性的在植株開花或接近開花時(shí)期的柱頭中表達(dá)。在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中,BoARC1能夠通過C端的臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域分別與SRK<,3>、SRK<,13b>和SRK<,910>的胞內(nèi)域相互作用。這些說明了BoARC1是SRK下游的一個(gè)保守信號(hào)成分,參與SI信號(hào)的傳遞。 BoARC1 含有 U-box 結(jié)構(gòu)域和臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),是植物中一類特有的蛋白質(zhì)。在系統(tǒng)進(jìn)化分析中,BoAR

10、C1 和 BnARC1 主要與擬南芥的 PUB17、煙草和馬鈴薯的 ACRE276 蛋白質(zhì)、水稻 ACRE 蛋白質(zhì)聚類在一起。而這些蛋白質(zhì)主要在植物的疾病防御方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。這暗示著 BoARC1 可能在植物其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也發(fā)揮著重要作用。 4.SI反應(yīng)途徑中蛋白質(zhì)磷酸化、泛素化的動(dòng)態(tài)變化利用磷酸化蛋白質(zhì)探針和免疫印跡方法,檢測羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和系自交授粉過程中柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的動(dòng)態(tài)變化

11、。發(fā)現(xiàn)自交授粉5 min的柱頭乳突細(xì)胞膜蛋白質(zhì)磷酸化水平出現(xiàn)高峰:自交授粉15 min的柱頭乳突細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)磷酸化水平出現(xiàn)高峰,隨后蛋白質(zhì)磷酸化又逐漸地恢復(fù)到未授粉水平。而在S<,13b>S<,13b>×14號(hào)雜交親和授粉過程中,蛋白質(zhì)磷酸化的動(dòng)態(tài)變化水平是比較穩(wěn)定的。此外,利用抗泛素抗體和免疫印跡方法,檢測羽衣甘藍(lán)S<,13b>S<,13b>自交不親和授粉過程中柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化水平變化。發(fā)現(xiàn)在自交授粉0.5 h蛋白質(zhì)泛素化水

12、平明顯增高,直到1h蛋白質(zhì)泛素化水平仍然維持著較高水平。而在S<,13b>S<,13b>×14號(hào)雜交親和授粉過程中,柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化水平并沒有出現(xiàn)增高的趨勢。蛋白質(zhì)磷酸化發(fā)生在SI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期階段,可能在調(diào)控柱頭乳突細(xì)胞對細(xì)胞外的信號(hào)識(shí)別及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞方面扮演著重要角色。而蛋白質(zhì)泛素化水平的變化發(fā)生在SI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的后期階段,可能通過降解柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)來參與SI反應(yīng)。蛋白質(zhì)磷酸化與泛素化的協(xié)同作用調(diào)控SI的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

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