無籽沙糖桔自交不親和泛素降解途徑關(guān)鍵基因的篩選.pdf

1、自交不親和（Self-incompatibility，SI）是被子植物中廣泛存在的促進(jìn)異花授粉，防止近親繁殖的遺傳機(jī)制。柑桔無籽是一種優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀，自交不親和是導(dǎo)致無籽的重要原因之一。研究表明，自交不親和反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能涉及到泛素降解途徑、Ca2+信號(hào)途徑、發(fā)育過程和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種途徑。本研究以無籽沙糖桔和有籽沙糖桔為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，結(jié)合已發(fā)表的與自交不親和相關(guān)的基因，篩選出與無籽沙糖桔自交不親和相關(guān)的候選

2、基因14個(gè)，并用q-PCR對(duì)候選基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1.以無籽沙糖桔和有籽沙糖桔的雌蕊、花粉，無籽沙糖桔自交、異交后不同時(shí)段的雌蕊（4 h，1~7 d）六個(gè)樣品用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。共獲得35.67 G堿基，306,462,978對(duì)雙端reads，樣品Q20達(dá)到96％以上，N50為1549，Unigene平均長(zhǎng)度897.99bp。各樣品reads數(shù)與組裝參考基因組比對(duì)率均在85%左右，測(cè)序數(shù)據(jù)可靠，可以滿足后續(xù)

3、實(shí)驗(yàn)分析需要。
　　2.根據(jù)表達(dá)量RPKM值及注釋信息，以FDR≤0.001且倍數(shù)差異不低于2倍為篩選條件，在WCPistils-VS- WSPistils中篩選出634條顯著差異基因，其中541條上調(diào)表達(dá)，93條下調(diào)表達(dá)；在YPistils-VS-WPistils中篩選出6555條顯著差異基因，其中2643條上調(diào)表達(dá)，3912條下調(diào)表達(dá)；在YPollen-VS-WPollen中篩選出2869條顯著差異基因，其中634條上調(diào)表達(dá)，

4、2235條下調(diào)表達(dá)。GO功能注釋結(jié)果表明，這些差異基因涉及到生殖過程、信號(hào)傳遞、免疫過程、刺激應(yīng)答、分子功能的正負(fù)調(diào)控、受體活性和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白活性等方面。KEGG注釋結(jié)果表明，這些差異基因主要涉及到植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、泛素/26S蛋白酶體途徑、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等通路。與泛素/26S蛋白酶體途徑密切相關(guān)的基因主要有：泛素激活酶 E1（Unigene0031440）；泛素結(jié)合酶E2（Unigene0049541和Uni

5、gene0034845）和泛素連接酶 E3（Unigene0038751、Unigene0031435、Unigene0034401、Unigene0029897、Unigene0023597和Unigene0035181）。
　　3.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合華中甜橙數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫和SSH cDNA文庫篩選到SSK-21、SSK-62、SSK-98、Cullin67和Ring5個(gè)與SI、泛素/26S蛋白酶體途徑相關(guān)的候選基因。<

6、br>　　4.利用q-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，在鑒定的43個(gè)差異基因中，有88.4%的表達(dá)趨勢(shì)與RNA-Seq結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。
　　5.用q-PCR對(duì)14個(gè)候選基因，在無籽沙糖桔、有籽沙糖桔不同組織以及無籽沙糖桔自交和異交授粉后不同時(shí)段（4 h，1、2、3、4、5、6和7 d）和不同組織（柱頭、花柱、子房）進(jìn)行表達(dá)特性分析，Unigene0031435、Unigene0038751、Unigene002989

7、7和Ring基因，在異交3 d后的花柱中上調(diào)表達(dá)，且都具有RING-finger結(jié)構(gòu)域，符合預(yù)期表達(dá)趨勢(shì)。表達(dá)特性表明，Unigene0031435、Unigene0038751和Unigene0029897可能是泛素/26S蛋白酶體途徑中關(guān)鍵酶基因。
　　6.對(duì)Ring基因做進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因與可可（Theobroma cacao）的同源性最高（90.0%），且與擬南芥（Arabidopsis thaliana）M