稻粒黑粉病、稻曲病病原真菌快速檢測方法研究.pdf

1、稻粒黑粉病是由Tilletia horrida Tak.引起的一種至使水稻穗部發(fā)病的真菌性病害。近年來，隨著雜交水稻的大力推廣和雜交稻制種量的明顯提高，稻粒黑粉病的發(fā)生日益嚴重，尤其是雜交水稻的制種田受害最為嚴重，該病害逐漸成為水稻的主要真菌病害之一。嚴重影響雜交水稻種子的品質和制種產(chǎn)量。對種子帶菌進行嚴格病原菌檢測，建立并實施植物檢疫制度，防止帶病的水稻種子向無病稻區(qū)去引入，從根本上防止稻粒黑粉病菌的傳播和擴散。因此，從源頭控制病害發(fā)

2、生，加強病原菌的檢測，為病害的預測預報、科學指導該病害的防治具有十分重要的意義。
　　稻曲病是由Ustilaginoidea virens(Cooke)Tanaka.引起的水稻谷粒真菌性病害。近年來，隨著雜交水稻高產(chǎn)品種的大力推廣和種植過程中氮肥使用水平的提高，稻曲病的田間發(fā)生逐年加重。稻曲病不但會影響水稻產(chǎn)量、降低稻米品質，還產(chǎn)生有害毒素對人和動物造成危害。目前防治稻曲病主要還是以藥劑防治為主，因此對稻曲病菌進行嚴格監(jiān)測和預報，

3、對指導生產(chǎn)工作中藥劑施用具有重要意義。
　　本研究采用Real-time PCR、dd PCR、MALDI-TOF-MS三種檢測技術分別對稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子進行快速檢測方法研究。針對稻粒黑粉病和稻曲病菌孢子建立了Real-time PCR快速檢測體系;對dd PCR技術在稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子的檢測應用進行了評估;通過MALDI-TOF-MS技術對細胞內特征大分子物質進行鑒定，得到稻粒黑粉病菌和稻曲病菌孢子的特征指紋圖

4、譜。研究結果如下:
　　1、稻粒黑粉病菌孢子Real-time PCR快速檢測體系的建立。基于Real-time PCR技術建立了稻粒黑粉病菌孢子量(y)和相應擴增Ct值(x)的標準曲線:y=-0.2966x+10.529，(R2=0.9974，P＜0.0001)。在定量種子中摻入已知濃度稻粒黑粉病菌孢子，其Real-time PCR檢測結果與摻入孢子數(shù)存在極顯著的正相關，無顯著差異(R2=0.9329，P＜0.0001)。對Re

5、al-time PCR標準曲線進行了可靠性驗證，技術重復的變異系數(shù)在0.46％-0.95％之間，表明本方法靈敏度高重復性好。
　　2、稻曲病菌孢子Real-time PCR快速檢測體系的建立。基于Real-time PCR技術建立了稻曲病菌孢子量(y)和相應擴增Ct值(x)的標準曲線:y=-0.2689x+10.508，(R2=0.9937，P＜0.0001)。在定量種子中摻入已知濃度稻曲病菌孢子，其Real-time PCR檢測

6、結果與摻入孢子數(shù)存在極顯著的正相關，無顯著差異(R2=0.9329，P＜0.0001)。對Real-time PCR標準曲線進行了可靠性驗證，技術重復的變異系數(shù)在0.45％-0.83％之間，該體系靈敏度高重復性好。
　　3、植物病原真菌孢子MALDI-TOF-MS檢測規(guī)范化條件的建立。本試驗從預處理方法、基質選用和點樣方法三方面比較MALDI-TOF-MS分析結果，對影響特征圖譜的主要因素進行優(yōu)化。結果表明，稻粒黑粉病菌和稻曲病菌