MicroRNA-148b促進(jìn)放射誘導(dǎo)的凋亡增強(qiáng)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的放射敏感性.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)是一組起源于淋巴結(jié)或其他淋巴組織的異質(zhì)性惡性腫瘤，根據(jù)其細(xì)胞來源分為B細(xì)胞型、T細(xì)胞型或NK細(xì)胞型。非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率在過去的四十年里明顯增長，1970年至1990年間幾乎翻倍。放射治療是非霍奇金淋巴瘤的主要治療手段之一。然而，約20％的疾病存在放射抗拒。因此，發(fā)展新的藥物來降低放射抗拒，增強(qiáng)這些疾病的放射敏感性是非常重要的。
　　MicroRNAs(miR

2、NAs)是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，長約20-22個(gè)核苷酸。miRNA結(jié)合到其靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)位點(diǎn)，根據(jù)二者序列互補(bǔ)性抑制基因表達(dá)或降解靶基因。值得注意的是，越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與調(diào)控細(xì)胞的放射敏感性。因此，miRNA可作為提高腫瘤放療效果的新靶點(diǎn)。本研究的目的是探討miRNA在調(diào)控非霍奇金淋巴瘤放射敏感性中的作用。
　　為了尋找調(diào)控非霍奇金淋

3、巴瘤放射敏感性的miRNA，我們利用miRNA芯片檢測非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞照射前后miRNA的表達(dá)差異。用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測Raji細(xì)胞的放射敏感性，發(fā)現(xiàn)臨床常用的分割劑量2 Gy可以導(dǎo)致約50%的生長抑制。因此，給予Raji細(xì)胞2 Gy照射。照射后4小時(shí)提取RNA用miRNA芯片進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以P值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，20個(gè)miRNA照射后有差異表達(dá)，其中10個(gè)上調(diào)，10個(gè)下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明，這些miRNA可能參與

4、放射敏感性的調(diào)控。
　　在差異表達(dá)的miRNA中，miR-148b在照射后表達(dá)上調(diào)1.53倍。為了驗(yàn)證miR-148b照射后表達(dá)上調(diào)，使用非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞和RL細(xì)胞，在不同照射劑量和照射后時(shí)間點(diǎn)，通過熒光定量RT-PCR檢測未照射組和照射組細(xì)胞中miR-148b表達(dá)水平的差異。結(jié)果表明，與未照射組細(xì)胞相比，照射組細(xì)胞中的miR-148b表達(dá)顯著上調(diào)，與芯片的結(jié)果一致。
　　由于miR-148b照射后表達(dá)上調(diào)，

5、我們假設(shè)其參與放射敏感性的調(diào)控。使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，我們利用miR-148b模擬劑(mimic)上調(diào)Raji細(xì)胞中miR-148b的表達(dá)，miR-148b抑制劑(inhibitor)下調(diào)Raji細(xì)胞中miRNA的表達(dá)。利用熒光顯微鏡，我們發(fā)現(xiàn)miRNA片段能夠成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入Raji細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率＞80%。進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證了miR-148b的上調(diào)和下調(diào)改變。
　　我們首先評(píng)估沒有照射時(shí)，miR-148B在體外對(duì)Raji細(xì)胞生

6、長的潛在影響。細(xì)胞增殖檢測表明，miR-148b上調(diào)的Raji細(xì)胞同對(duì)照組相比，細(xì)胞生長速度明顯降低。另一方面，miR-148b下調(diào)的Raji細(xì)胞細(xì)胞生長速度明顯增加。接下來，我們將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行照射。細(xì)胞增殖檢測表明，照射2Gy或4Gy后，miR-148b上調(diào)組和對(duì)照組同未照射時(shí)相比，Raji細(xì)胞死亡增加。然而，miR-148b上調(diào)照射組同對(duì)照照射組相比，細(xì)胞死亡明顯增加。這些結(jié)果支持假設(shè)，即miR-148b上調(diào)增加了Raji細(xì)胞的

7、放射敏感性。為進(jìn)一步證實(shí)miR-148b對(duì)放射敏感性的調(diào)控作用，我們使用miR-148b抑制劑，觀察其能否誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的放射抵抗。正如所預(yù)期的，我們發(fā)現(xiàn)miR-148b下調(diào)組同對(duì)照組相比，明顯地對(duì)放射抗拒。這些結(jié)果表明，miR-148b對(duì)Raji細(xì)胞的放射敏感性有重要的調(diào)控作用。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)miR-148b可以增強(qiáng)Raji細(xì)胞的放射敏感性，我們進(jìn)行了集落形成實(shí)驗(yàn)，并獲得了類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-148b模擬劑的Raji

8、細(xì)胞同對(duì)照組相比，照射后集落形成能力明顯降低。相反地，轉(zhuǎn)染miR-148b抑制劑的Raji細(xì)胞明顯對(duì)放射抗拒。這些結(jié)果提供了進(jìn)一步的證據(jù)表明，miR-148b增加了Raji細(xì)胞的放射敏感性。
　　接下來，我們探討miR-148b對(duì)放射敏感性的影響是否是由于細(xì)胞周期的改變。流式細(xì)胞儀分析表明，miR-148b模擬劑和抑制劑不影響Raji細(xì)胞的細(xì)胞周期。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，給予細(xì)胞0Gy、2Gy和4Gy的X射線照射，24 h后再進(jìn)行分析。

9、Raji細(xì)胞照射后表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性G2/M期阻滯。然而，同對(duì)照組相比，miR-148b模擬劑和抑制劑對(duì)Raji細(xì)胞照射后的細(xì)胞周期沒有影響。
　　凋亡是惡性腫瘤細(xì)胞死亡的重要機(jī)制。我們探討miR-148b是否通過誘導(dǎo)凋亡增強(qiáng)Raji細(xì)胞的放射敏感性。Raji細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-148b模擬劑和抑制劑后，培養(yǎng)24小時(shí)，然后接受不同劑量的照射（0 Gy、2Gy和4Gy），24小時(shí)后進(jìn)行Annexin V/PI雙染色及流式細(xì)胞儀分析。

10、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞也在照射后24小時(shí)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在照射0 Gy、2Gy和4Gy時(shí)，miR-148b高表達(dá)組的凋亡細(xì)胞比例均明顯比對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組高(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，miR-148b可以促進(jìn)放射誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞凋亡。
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，抗凋亡基因Bcl-w可能是miR-148b的靶基因。進(jìn)一步的研究表明，miR-148b可以抑制Raji細(xì)胞中Bcl-w基因mRNA和蛋白的表達(dá)。Bcl-w蛋白是Bcl-2家族中抗凋亡

11、蛋白的重要一員，而Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮極為重要的調(diào)控作用。由此，我們提出假說，miR-148b抑制Bcl-w的表達(dá)，通過激活線粒體凋亡途徑增強(qiáng)非霍奇金淋巴瘤的放射敏感性。此假說有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　綜上所述，我們的結(jié)果表明，miR-148b促進(jìn)放射誘導(dǎo)的凋亡增強(qiáng)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的放射敏感性。miR-148b可以被用來預(yù)測非霍奇金淋巴瘤的放射敏感性。此外，改變miR-148b的表達(dá)可能是一種很有前途的治療方案。