與中國北方人群強直性脊柱炎關(guān)聯(lián)的HLAⅢ類基因區(qū)易感基因的識別和驗證研究.pdf

1、目的：在HLAⅢ類基因區(qū)二代測序和生物信息學篩選基礎(chǔ)上，識別和驗證與北方中國人群強直性脊柱炎（AS）遺傳易感性相關(guān)聯(lián)的基因變異。
　　方法：1)篩選本研究組通過高通量二代測序平臺，對25例hla-b27陽性AS重癥患者HLAⅢ類基因區(qū)進行深度測序，經(jīng)過BWA軟件的比對和samtool軟件讀取的變異，在該區(qū)域中經(jīng)生物信息學手段篩選出11個次要等位基因頻率小于5％的低頻罕見變異。2)識別先在一個340個病例和370個對照的小樣本中進行

2、AS關(guān)聯(lián)的易感基因的識別研究，使用PCR-HRM和PCR-RFLP分型方法并結(jié)合隨機抽樣測序驗證分型的結(jié)果。3)驗證將小樣本中統(tǒng)計分析有意義的位點，進行較大樣本（927病例和956對照）北方人群AS易感基因的關(guān)聯(lián)性研究，通過病例對照關(guān)聯(lián)研究，分型方法為PCR-HRM和PCR-RFLP，結(jié)合隨機抽樣測序驗證分型的結(jié)果。4）分析用SPSS分析各變異位點等位基因和基因型在病例組和對照組中的分布情況，及不同遺傳模型中基因型的分布情況。經(jīng)HWE檢

3、測,11個次要等位基因頻率在對照人群中符合HWE平衡條件,用haploview軟件進行連鎖不平衡檢驗（LD）及單體型關(guān)聯(lián)分析，進行與AS關(guān)聯(lián)的危險基因型的累積效應分析，用多因子降維法（MDR）分析病例對照中各位點基因交互作用，識別具有意義的易感位點（P<0.05）。
　　結(jié)果：1)篩選對25例HLA-B27陽性AS重癥患者HLAⅢ類基因區(qū)進行深度測序。在該區(qū)域中經(jīng)生物信息學手段篩選出11個次要等位基因頻率小于5%的低頻罕見變異。2

4、)識別在340個病例和370個對照的第一階段小樣本群體中的識別研究結(jié)果顯示,aif1（rs371747459，A>G），bag6（rs201165258，A>G），ncr3（rs3179004，G>A），hspa1b（rs11576014，G>A），skiv2l（rs144147284，G>A）,tnxb（rs141190850，A>G），Chr6：g.31446930（C>A）和tnxb（rs139531139，G>A）共計識別到8個

5、有顯著性差異（P<0.05）的變異位點。3)驗證這8個變異位點第二階段較大樣本群體的病例組與對照組中的等位基因分布均有差異（P<0.05），他們基因型頻率的共顯模型，顯性模型和超顯模型有意義。4）分析較大樣本單倍型分析結(jié)果：組合1顯示Chr6：g.31446930和rs3179004組成的單體型CG、CA、AG，組合2顯示rs371747459，rs201165258，rs11576014，rs144147284，rs139531139

6、和rs141190850組成的單體型AAGGGA、GGGGGA、AAGAAG，組合3顯示Chr6：g.31446930，rs3179004，rs371747459和rs201165258組成的單體型CGAA、CGGG、CAAA、AGAA，組合4顯示rs144147284，139531139和rs141190850組成的單體型GGA、AAG在病例組和對照組的分布具有差異性（P<0.05）。累積效應分析結(jié)果顯示：隨著攜帶危險基因型數(shù)目的增多

7、，OR值由1增加到12.639，再增加到18.727，含有越多危險基因型個數(shù)，患AS風險性越大。MDR分析顯示：包含rs371747459、rs139531139、rs3179004和rs201165258這4個位點的最佳模型的testing P<0.0001,交叉驗證一致性為10/10，檢驗樣本的準確度為0.6528。MDR環(huán)狀圖結(jié)果提示rs371747459、rs139531139、rs3179004和rs201165258這4個位

8、點之間有交互作用，然而只有rs139531139和rs3179004之間有協(xié)同作用。
　　結(jié)論：我們通過三步走的方法，1.在HLA-Ⅲ類基因區(qū)域中篩選出11個次要等位基因頻率小于5%的低頻罕見變異，2.在小樣本群體中識別出8個可能與AS相關(guān)聯(lián)的易感位點，3.在較大樣本多群體中驗證結(jié)果顯示這8個易感位點可能與AS相關(guān)聯(lián)。單個基因分析：aif1（rs371747459，A>G），bag6（rs201165258，A>G），ncr3（r

9、s3179004，G>A），hspa1b（rs11576014，G>A），skiv2l（rs144147284，G>A）,tnxb（rs141190850，A>G），Chr6：g.31446930（C>A）和tnxb（rs139531139，G>A）這8個變異位點在病例組與對照組中的等位基因分布均有差異（P<0.05），他們基因型頻率的共顯模型，顯性模型和超顯模型有意義。這8個變異位點可能與AS的易感性相關(guān)聯(lián)。多個基因分析：1）累積效應

10、分析顯示隨著危險基因型的數(shù)目增多，OR值增大，患AS風險性越大；2）單倍型分析結(jié)果顯示多個單倍型具有統(tǒng)計學意義，他們可能在遺傳上共同影響AS患者的發(fā)?。?）MDR結(jié)果顯示rs371747459、rs139531139、rs3179004和rs201165258這4個位點構(gòu)成最佳模型，rs139531139和rs3179004之間有協(xié)同增加易感性的風險效用。我們實驗中找到的這8個前人未報道過的易感位點可能與AS相關(guān)聯(lián)，我們進一步的研究包括