oxLDL與動脈粥樣硬化的相關(guān)性研究——oxLDL與動脈粥樣硬化關(guān)系的臨床觀察研究——體外阻斷oxLDL對內(nèi)皮細胞損傷的實驗研究.pdf

1、研究背景: 以動脈粥樣硬化（atheroselerosis，AS）為主要病理改變的心腦血管疾病嚴重威脅著人類。動脈粥樣硬化發(fā)病機制復雜，目前得到廣泛認可的為損傷-反應(yīng)學說和由此發(fā)展的炎癥理論。免疫機制在AS的形成、發(fā)展中起重要作用，多種參與免疫反應(yīng)的細胞和分子相互協(xié)同、相互影響，促進了AS的發(fā)生發(fā)展。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoproteirt，oxLDL）在AS中的作用正日益受到重視。O

2、xLDL是低密度脂蛋白（LDL）在體內(nèi)發(fā)生氧化修飾而形成的，此反應(yīng)與體內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)。LDL氧化修飾后，理化性質(zhì)和生物學特性均發(fā)生了一系列改變，可以通過細胞毒性作用、化學趨化作用、影響血管平滑肌增殖、加速泡沫細胞形成、影響纖溶和凝血等機制促進AS的發(fā)生和進展。另外，oxLDL具有免疫原性，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性自身抗體（oxLDL-Ab）。氧化低密度脂蛋白及其抗體均參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，在疾病的進程中發(fā)揮著重要的作用，對其

3、研究很多，但是，目前研究結(jié)論卻有很大的差異，有些甚至十分矛盾。有些病例對照研究表明病人體內(nèi)oxLDL和oxLDL-Ab水平顯著高于正常對照，oxLDL的水平可提供重要的診斷信息，oxLDL-Ab可作為動脈粥樣硬化的獨立危險因素；然而也有研究報道oxLDL-Ab水平與動脈粥樣硬化程度呈現(xiàn)負相關(guān)，oxLDL-Ab可發(fā)揮保護作用。這些相互矛盾的結(jié)果反映了動脈粥樣硬化中免疫機制的復雜性。 動脈粥樣硬化是多階段慢性演變的過程，包括血管內(nèi)皮

4、損傷、單核細胞和淋巴細胞粘附和侵入內(nèi)皮轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎⒅y形成，平滑肌細胞遷移至內(nèi)膜增生形成纖維斑塊，之后逐步演變?yōu)橹鄻影邏K，斑塊不穩(wěn)定或破裂導致臨床上急性事件的發(fā)生等復雜過程。動脈粥樣硬化斑塊主要侵犯彈性型的大動脈和中等管徑的動脈，其中頸動脈是腦供血的主要通路，此部位的粥樣硬化斑塊越來越多地被發(fā)現(xiàn)。頸動脈粥樣硬化斑塊導致狹窄從而引起血流動力學改變的并不多，相對來講，粥樣斑塊的性質(zhì)更為重要。病變?nèi)籼幱诜€(wěn)定期則影響不大，而不穩(wěn)定時斑塊潰破

5、可直接導致腦卒中的發(fā)生。腦卒中具有高的病死率和致殘率，對人體危險性很大。對不穩(wěn)定斑塊行外科手術(shù)切除為該病的二級預防提供了新途徑。因此，對斑塊穩(wěn)定性的分析和研究非常重要。本文對確診有頸動脈粥樣硬化病變但病變處于穩(wěn)定期的高危險性人群進行流行病學研究，分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危險因素與頸動脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)，可為AS的防治提供基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實意義。 OxLDL可通過多種作用途徑促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其中

6、誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡為其初始作用之一。細胞凋亡即程序性細胞死亡，是生物體內(nèi)廣泛存在的一種為維護體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細胞接受某種信號或受到某些因素刺激后由特定基因控制的、以細胞DNA有控降解為特征的、無明顯細胞溶解現(xiàn)象的細胞自主有序性死亡。細胞凋亡在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，尤其是內(nèi)皮細胞的凋亡機制參與了動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各過程，可影響內(nèi)皮細胞正常功能、促進血栓形成、參與血管重構(gòu)、影響動脈形態(tài)與結(jié)構(gòu)，具有重要意義。 大蒜及從中提

7、取的大蒜油具有廣泛的藥理作用，包括抗病原微生物、抗腫瘤、增強免疫系統(tǒng)功能、抗氧化、抗衰老、保護肝臟、防治糖尿病等，尤其可通過多種機制對心腦血管系統(tǒng)疾病產(chǎn)生顯著的預防和治療作用，其中，保護內(nèi)皮細胞為其機制之一。人體必需微量元素硒（Se）也對心血管系統(tǒng)具有保護作用，其水平與心血管疾病的發(fā)病率呈明顯負相關(guān)，還具有抗氧化、解毒等其他多方面生物學效應(yīng)。大蒜和硒聯(lián)合應(yīng)用是否能發(fā)揮協(xié)同保護作用是該領(lǐng)域一直關(guān)注的問題。但是由于大蒜油的PH在5．3到5．

8、8之間，而亞硒酸鈉的PH為11．0左右，兩者直接混合聯(lián)用會破壞大蒜素；而且亞硒酸鈉中的硒為無機硒，其在體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)換率難以確定。采用微膠囊技術(shù)可將大蒜油和硒聯(lián)合，然而這種劑型很難用實驗研究確定其效能。富硒大蒜的培育開發(fā)為將二者聯(lián)合應(yīng)用、評價其可能的保健或治療作用提供了契機。 已有研究證明，富硒大蒜可保護心腦血管系統(tǒng)，但具體機制目前尚未闡明，尤其對oxLDL所致的內(nèi)皮細胞損傷的作用尚未見研究報道。因此，本文以山東蒼山培育的富硒大蒜

9、為原料，從中提取大蒜油，測定其中大蒜素和硒的含量；并用ox-LDL作用于體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞（ECV304細胞株）誘導其凋亡，進而用提取的富硒大蒜油進行干預，觀察其對ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞損傷的阻斷作用，并對作用機理進行初步探討。 研究目的: 本文以頸動脈內(nèi)膜增厚和/或有斑塊形成、但未發(fā)生急性臨床事件者為病例，以頸動脈正常者為對照，運用單純病例研究和病例對照研究，分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危險因

10、素與頸動脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)，并分析oxLDL與自身抗體的關(guān)系，以了解與AS有關(guān)聯(lián)的免疫機制，為AS的防治研究提供科學依據(jù)。 用oxLDL作用于體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞株ECV304，誘導其凋亡，進而用提取的富硒大蒜油進行干預，通過測定細胞存活率、細胞活性、細胞凋亡率及細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達及其mRNA水平的變化以研究oxLDL對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用，探討富硒大蒜油對此損傷的影響及可能機制，確定其是否有保護作用及所需劑量，為進一步研究

11、其預防AS的功能提供基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容和方法: 一．oxLDL與動脈粥樣硬化關(guān)系的臨床觀察研究 1．研究對象的選擇; 2．頸動脈超聲檢查; 4．實驗檢測內(nèi)容和方法; 5．統(tǒng)計方法。 二．體外阻斷oxLDL對內(nèi)皮細胞損傷的實驗研究 采用乙醇提取加橄欖油萃取法和水蒸氣蒸餾加橄欖油萃取法分別從一般大蒜和富硒大蒜中提取大蒜油，同時制備大蒜勻漿，采用高效液相色譜法測定處理后不同組分大蒜

12、素含量，氫化物發(fā)生原子熒光法測定其中的硒含量。采用銅離子誘導法將LDL體外氧化修飾成oxLDL，蘇丹黑預染的瓊脂糖凝膠電泳及TBARS測定法鑒定LDL氧化程度。應(yīng)用水蒸氣蒸餾加橄欖油萃取法所得大蒜油進行細胞培養(yǎng)實驗。ECV304細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，其中青霉素、鏈霉素濃度均為100U/mL，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。將處于對數(shù)生長期的ECV304細胞用0．25％胰蛋白酶消化，用含

13、10％新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度為2×104/ml，取適量細胞懸液接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶。臺盼藍染色法檢測細胞存活率；甲基四唑藍（MTT）比色法檢測細胞活性，求得10％的細胞生長受抑制所需要的一般大蒜油、富硒大蒜油及無機硒標準溶液濃度（IC10），選取低于IC10的濃度進行實驗。實驗分為8組：對照組、oxLDL組、一般大蒜油組、oxLDL+一般大蒜油組、富硒大蒜油組、oxLDL+富硒大蒜油組、硒標準溶液組、oxLDL+

14、硒標準溶液組。所加一般大蒜油終濃度為5μl/L，富硒大蒜油終濃度為2．5μl/L，硒標準溶液終濃度為0．02μg/ml，oxLDL終濃度為22μg/ml。其中oxLDL+大蒜油組為先加入大蒜油作用24h后再加oxLDL作用。MTT法檢測細胞活性，流式細胞儀Annexin V-FITC/PI染色法測定細胞凋亡率。對照組、oxLDL組、富硒大蒜油組、oxLDL+富硒大蒜油組瑞氏-吉姆薩染色光鏡下觀察細胞形態(tài)學改變，Western blot測

15、定細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA水平的變化。 結(jié)論: 1．對于頸動脈粥樣硬化病變穩(wěn)定期的病人，體內(nèi)血液循環(huán)中的氧化低密度脂蛋白（oxLDL）與其自身抗體（oxLDL-Ab）水平無關(guān)。 2．血液循環(huán)中的o

16、xLDL在頸動脈粥樣硬化病人體內(nèi)顯著高于對照，但在穩(wěn)定期病例中與病變的程度無關(guān)。 3．血液循環(huán)中的oxLDL-Ab在頸動脈粥樣硬化病人體內(nèi)顯著低于對照，但在穩(wěn)定期病例中與病變的程度無關(guān)。 4．oxLDL及oxLDL-Ab可預測AS的危險性，可作為高危人群是否需要進行AS斑塊檢查的初篩指標。 5．oxLDL具有明顯的細胞毒作用，可以誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡，此作用可能是通過影響B(tài)cl-2、Bax和caspase-3的基