牙齦卟啉單胞菌莢膜相關(guān)的表型和遺傳多態(tài)性研究.pdf

1、牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周病、尤其是慢性牙周炎病損區(qū)域或炎癥進展部位最主要的優(yōu)勢致病菌，它的存在與牙周病炎癥進展或復發(fā)有關(guān)，是目前公認的慢性牙周炎的主要致病菌。P.gingivalis具有多種毒力因子，其中莢膜作為細菌表面結(jié)構(gòu)，常與磷脂或脂質(zhì)A共價結(jié)合形成菌體的最外層，與宿主發(fā)生直接反應。學者發(fā)現(xiàn)莢膜明顯的菌株具有高親水性、抵抗宿主血清殺傷、細胞吞噬等性質(zhì)，較符合早

2、期發(fā)現(xiàn)的侵襲性高毒菌株的特點，由此認為莢膜與P.gingivalis高毒菌株存在明顯關(guān)聯(lián)。研究表明不同P.gingivalis菌株的生物學性質(zhì)和毒力性質(zhì)存在廣泛差異，不同、甚至相同K血清型的P.gingivalis菌株毒力的差異，可能是不同的莢膜化程度通過影響莢膜相關(guān)的生物學性質(zhì)所造成的。莢膜更明顯的菌株顯示出自凝集作用減弱，浮力密度下降，更具親水性，對多形核白細胞吞噬和血清殺傷的抵抗作用增強，活化替代補體途徑的能力下降，還可能作為物理

3、性屏障保護內(nèi)面的脂多糖不激活補體級聯(lián)反應，從而避免被宿主的調(diào)理和吞噬作用所清除，保護菌體避免或減少受溶菌酶、抗菌抗體、抗菌藥物等有害物質(zhì)的損傷。此外，莢膜相關(guān)的遺傳異質(zhì)性是細菌相關(guān)生物學性質(zhì)和毒力性質(zhì)差異的物質(zhì)基礎(chǔ)?；赑.gingivalis W83的基因組測序研究，學者們發(fā)現(xiàn)了多重潛在的多糖合成基因島，但這些基因島的功能并不完全明了。還有研究通過失活某些莢膜相關(guān)基因，觀察到基因敲除株表現(xiàn)有多糖合成異常，在莢膜厚度、表面結(jié)構(gòu)、生物學性

4、質(zhì)上發(fā)生了改變。目前，P.gingivalis致病性和莢膜的關(guān)系已引起國外學者的廣泛關(guān)注，而國內(nèi)尚未見報道。
　　本研究將利用前期從我院牙周科門診分離得到的5株P(guān).gingivalis臨床菌株，分別命名為SJD2、SJD4、SJD5、SJD11、SJD12，以高毒力且莢膜明顯的模式菌株W83及低毒力且不表達莢膜K抗原的模式菌株ATCC33277為對照，從生長、形態(tài)、生化代謝等生物學特性，以及莢膜相關(guān)的病原相關(guān)性質(zhì)等表型特性，對7株

5、P.gingivalis菌株的多樣性進行研究。另外，從莢膜相關(guān)功能基因和基因島的遺傳多態(tài)性，以及基因表達水平和基因功能等方面，對P.gingivalis菌株莢膜相關(guān)的遺傳多樣性進行分析。初步探討不同P.gingivalis菌株莢膜與其致病性間的關(guān)系，為牙周病病因?qū)W研究和生物治療模式提供理論依據(jù)。
　　本研究第一部分通過光學顯微鏡觀察了7株P(guān).gingivalis菌株的菌體形態(tài)，比較了各菌株的生長速度，并使用API20A和ATB R

6、apid ID32A生化代謝反應檢測系統(tǒng)檢測分析各菌株的生化代謝反應，對P.gingivalis臨床菌株生物學特性的多樣性進行了研究。在光學顯微鏡和透射電鏡觀察各菌株莢膜結(jié)構(gòu)和厚度的基礎(chǔ)上，檢測和比較了各菌株與細菌粘附定植相關(guān)的表面疏水性質(zhì)，生成生物膜的能力，凝集紅細胞的能力，牙齦素的活性；以及與細菌逃避宿主防御相關(guān)的耐受血清殺傷和抗生素的能力，對P. gingivalis臨床菌株莢膜相關(guān)致病性質(zhì)的多樣性，以及與莢膜厚度和菌株毒力性質(zhì)之

7、間的關(guān)系進行了研究。
　　本研究第二部分通過對fimA基因的全長測序和遺傳進化樹的構(gòu)建，分析P.gingivalis菌株fimA基因型和莢膜厚度的關(guān)聯(lián)。在對P.gingivalis各菌株的莢膜相關(guān)基因和基因島的同源比對分析的基礎(chǔ)上，通過模擬限制性片段長度多態(tài)性分析和基因序列比對，分析了菌株間PG0106-PG0120基因島的高度異質(zhì)性。此外，采用實時定量PCR檢測了PG0435-PG0437基因島的表達水平，并嘗試插入失活PG04

8、35基因來分析PG0435基因的功能。探討P.gingivalis菌株莢膜相關(guān)的遺傳多樣性。
　　結(jié)果如下：
　　1.P.gingivalis臨床菌株的生長速度、菌體形態(tài)、生化代謝等表型特征呈現(xiàn)了與模式菌株的同質(zhì)性，菌株間僅存在個別差異。P.gingivalis菌株以多肽或者氨基酸作為主要碳源或氮源，但存在部分糖代謝的能力。此外，ATB Rapid ID32 A可能更適合用于齦下菌斑中革蘭氏陰性厭氧菌的生化反應檢測和鑒定。<

9、br>　　2.P.gingivalis菌株的莢膜厚度各異，與細菌毒力性質(zhì)間未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性。莢膜的厚度與細菌表面親疏水性質(zhì)和自凝集反應、及逃逸血清殺傷等性質(zhì)在一定程度上相關(guān)聯(lián)，莢膜較厚的菌株顯示出更強的表面親水性、不易發(fā)生自凝集反應、并且更易逃逸宿主補體的殺傷；但是莢膜厚度并未與P.gingivalis形成生物膜、凝集紅細胞、牙齦素活性等性質(zhì)表現(xiàn)有明顯關(guān)聯(lián)。
　　3.受試的P.gingivalis菌株對臨床常用的抗生素或抗生素配

10、伍均敏感。
　　4.fimAⅠ型和Ⅰb型菌株的莢膜較??；fimAⅡ型和Ⅲ型菌株的莢膜較厚，提示fimA基因型的差異可能與莢膜的厚度存在一定程度的關(guān)聯(lián)。
　　5.大部分莢膜相關(guān)基因及莢膜相關(guān)基因島PG1135-PG1142、PG0435-PG0437和PG1560-PG1565在P.gingivalis菌株間的異質(zhì)性較小，均較為保守。但各菌株間基因島PG0106-PG0120的異質(zhì)性明顯，該基因島部分基因的缺失、同源基因的替代

11、、個別基因的插入可能是造成各菌株莢膜厚度差異的原因。
　　6.SJD2和SJD5在生物學性質(zhì)和遺傳背景上均表現(xiàn)為高度一致性，但其毒力性質(zhì)相反。
　　7.P.gingivalis各菌株不同生長時期PG0435-PG0437基因島相對表達水平與莢膜厚度間未顯示有關(guān)聯(lián)。PG0435基因可能是P.gingivalis的必須基因，但仍需要進一步驗證。
　　綜上所述，P.gingivalis菌株間莢膜相關(guān)的表型特征和基因背景具有多