牙齦卟啉單胞菌RgpA、Kg基因疫苗與IL-4聯合免疫效應研究.pdf

1、背景:
　　 種植體周圍炎是種植體植入后的常見并發(fā)癥之一，也是種植修復失敗的主要原因[1，2]，目前微生態(tài)學的觀點認為，種植體周圍炎是齦下優(yōu)勢菌群易主的結果。牙齦卟啉單胞菌被認為是牙周炎及種植體周圍炎的主要可疑致病菌，國內外學者已針對牙齦卟啉單胞菌的牙周炎防治進行了大量研究，并深入到分子水平，取得了一定進展[3-5]。
　　 牙齦蛋白酶是牙齦卟啉單胞菌的主要致病因子，在前期實驗中，我們已證實，應用牙齦卟啉單胞菌rgpA、

2、kgp基因構建的RgpA、KgpA基因疫苗均能夠誘導實驗性種植體周圍炎有效的免疫反應，然而，我們也觀察到，在實驗過程中動物機體產生的特異性抗體功能性水平較低，維持免疫實效期較短，如何提高基因疫苗的靶向性和高效性是我們面臨的主要問題。
　　 基因疫苗的免疫效果受動物個體差異的影響較大，如何提高和改善DNA疫苗的免疫效果是當今DNA免疫研究的熱點，有效方法之一是加入免疫佐劑，如鋁鹽膠體、細胞因子、脂質體、協(xié)同信號因子、寡核昔酸短序列

3、等。其中細胞因子具有明顯的免疫佐劑效應，它們在體內緩慢而持久地釋放，可增強病毒、細菌、寄生蟲疫苗的保護效果，IL-4是目前明確的具有免疫佐劑的細胞因子之一[6-7]。IL-4是具有抗炎作用的細胞因子，促進以Th2細胞為特征的免疫應答，它可以特異性作用于為致病抗原致敏的B淋巴細胞，調節(jié)調節(jié)T，B淋巴細胞的分化、活化，增強抗原遞呈細胞功能，協(xié)助基因疫苗持續(xù)表達高水平特異性抗體。在本項目的前期實驗中，將RgpA、Kgp基因疫苗與人IL-4重組

4、質粒聯合應用于大鼠體內，證實可有效增強疫苗對實驗性牙周炎的免疫效果。本研究是將PVAX1-rgpA、PVAX1-kgp和PVAX1-IL-4真核質粒對犬種植體周圍炎模型進行基因聯合免疫，以期誘導機體產生較強的自身免疫反應，觀察檢驗其在防治該類動物口腔內種植體周圍炎發(fā)生發(fā)展中的作用，同時對比RgpA、Kgp基因疫苗免疫原性，探索具有高效性和強靶向性的種植體周圍炎基因疫苗。
　　 目的:
　　 將PVAX1-rgpA、PVA

5、X1-kgp和PVAX1-IL-4真核質粒，聯合免疫種植體周圍炎動物實驗模型，驗證人IL-4對RgpA、Kgp基因疫苗的免疫增強作用，為臨床應用提供實驗依據。
　　 方法:
　　 1、真核表達質粒PVAX1-RgpA、PVAX1-Kgp,PVAX1-IL-4細菌復蘇及質粒大量提取。
　　 2、10只實驗犬被隨機分成A、B、C、D、E五組，拔除下頜雙側第二、三前磨牙后隨機植入螺紋圓柱型種植體，每只動物植入4枚。3個

6、月后，骨結合良好，分別以PVAX1質粒、PVAX1-kgp、PVAX1-rgpA、PVAX1-kgp+PVAX1-IL-4PVAX1-rgpA+PVAX1-IL-4分組免疫，每兩周重復免疫一次，共計3次。
　　 3、綁線結扎法構建種植體周圍炎模型，綁線后2、4、6周時進行種植體周探診深度(PPD)檢測，探診出血指數(BOP)檢測，拍攝X線片觀察骨結合情況。
　　 4、每次免疫接種前收集血液，檢測血清中IgG抗體水平。

7、r>　　 5、動物過量麻藥處死，將種植體及其周圍軟硬組織制作硬組織切片，亞甲基蘭染色，鏡下觀察并測量垂直性和水平性骨喪失程度。
　　 結果:
　　 1、各組動物種植體周探診深度在綁線后2周開始出現開始差異，4周時差異有統(tǒng)計學意義，B、C、D、E組較A組PPD值小(P＜0.05)。探診出血指數(BOP)在各組間有所不同，但無統(tǒng)計學意義的差別（P＞0.05）。
　　 2、動物免疫結束后結果顯示，各組動物免疫后較免疫

8、前IgG抗體水平均有增加，但B、C、D、E組動物IgG抗體較未免疫前明顯增高(P＜0.05)，且較A組顯示出更高的抗體水平(P＜0.05)，A組免疫后較免疫前無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。D、E組較B、C組抗體反應更明顯(P＜0.05)，且B組較C組、D組較E組各兩組間IgG抗體水平差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、組織切片觀察在種植體周骨喪失區(qū)有炎性細胞浸潤，A組骨喪失較嚴重，B、C、D、E組綁線側種植體骨喪失較A