有機鍺聯合二甲雙胍對2型糖尿病大鼠治療增敏作用的實驗研究及機制探討.pdf

1、無論是在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，糖尿病正以迅速發(fā)展的勢頭成為現代社會的流行病，嚴重危害公眾健康。據WHO統(tǒng)計，2000年糖尿病的發(fā)病率為2.8％，約有1.71億患者;到2030年預計將增長到4.4％，患病人數高達3.66億。糖尿病及其并發(fā)癥不僅影響了患者生活質量，也對社會醫(yī)療保健帶來沉重經濟負擔。
　　 目前2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)尚無根治方法，主要以對癥治療為主，長期藥物治療會使治

2、療效果降低。鹽酸二甲雙胍是2型糖尿病治療的基礎用藥，二甲雙胍的降糖作用主要是增加糖無氧酵解和抑制肝糖異生、降低肝糖輸出，近年來大量研究證實，二甲雙胍可通過增高糖尿病狀態(tài)下骨骼肌GLUT4mRNA和蛋白水平，促進骨骼肌中GLUT4的轉位來增加周圍組織對胰島素的敏感性。
　　 近年來研究發(fā)現，微量元素在胰島素的生成、作用發(fā)揮以及糖尿病人的能量代謝中起著極為重要的作用，微量元素鉻、硒、鋅對骨骼肌細胞膜上的GLUT4的表達均有影響，鍺元

3、素在抗氧化應激等方面與鉻、硒、鋅很相似，已有文獻報道，有機鍺(Ge-132)對糖尿病小鼠具有明顯的預防血糖升高的作用，然而，國內尚未見其在2型糖尿病治療方面的相關實驗研究，本實驗通過觀察有機鍺(Ge-132)聯合鹽酸二甲雙胍對2型糖尿病治療的影響，初步探討其相關機制。
　　 研究目的：
　　 本實驗通過觀察聯合應用鹽酸二甲雙胍和有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病大鼠治療的影響，為2型糖尿病的預防和治療提供新的思路和方向。

4、
　　 方法：
　　 一、2型糖尿病大鼠模型的制備
　　 本實驗利用高糖高脂飲食誘導聯合小劑量STZ腹腔注射的方法制備2型糖尿病動物模型，具體方法為:
　　 （一）、動物分組及處理
　　 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，逐一稱重，隨機分成2組，實驗組40只，空白對照組10只。實驗組飼糖尿病大鼠專用飼料;對照組飼喂實驗大鼠普通飼料4周后，全部大鼠禁食不禁水12 h，測空腹血糖并稱重，然后給實驗組大鼠一性腹腔注

5、射STZ30rag/(kg.Bw)，以空腹血糖值≥7.8mol/L為標準。
　　 （二）、糖耐量實驗
　　 為驗證所制備的糖尿病大鼠模型為2型糖尿病模型，進行口服葡萄糖耐量試驗:建模成功后，隨機選取實驗組及空白對照組大鼠各10只，乙醚吸入式麻醉后，眶靜脈叢取血，測其空腹血糖(0min)，留取1ml血液，3000r/min離心15min后分離血清待測空腹血清胰島素(0min)后，按2g/kg予以50％葡萄糖溶液灌胃，于糖負

6、荷后30、60、120、180 min測定即時血糖，并于每一時點取血1 ml，離心分離血清（方法同前），-20℃保存，待測血清胰島素;計算胰島素曲線下面積;穩(wěn)態(tài)模型法評估胰島素抵抗，胰島素抵抗的標準:HOMA-IR與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　 二、有機鍺聯合鹽酸二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響
　　 （一）實驗動物的分組
　　 將建模成功的40只SD大鼠隨機分為四組:模型對照組、二甲雙胍組、有機鍺(

7、Ge-132)組、二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組。動物飼養(yǎng)在清潔級動物房，5只一籠，實驗組與空白對照組同樣飼喂實驗大鼠普通飼料，自由飲食及去離子水;環(huán)境溫度為25℃±1℃，相對濕度為40％-60％;飼養(yǎng)員晝夜循環(huán)為12h/12h(8:00am-8:00pm)。
　　 （二）實驗處理
　　 1、實驗組大鼠血糖穩(wěn)定一周后，空白對照組和模型對照組:0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5ml/kg.d灌胃;二甲雙胍組:鹽酸

8、二甲雙胍CMC-Na混懸液200mg/kg.d灌胃;有機鍺(Ge-132)組:Ge-132CMC-Na混懸液20mg/kg.d灌胃;二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組:鹽酸二甲雙胍CMC-Na混懸液200mg/kg.d+ Ge-132 CMC-Na混懸液20mg/kg.d灌胃。每周一、五測體重;周二、六測進食量、飲水量;周日測空腹血糖。各組試驗干預均為8周。觀察各組空腹血糖差異。
　　 三、有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療

9、具有增效作用機制的初步探討
　　 （一）實驗動物的分組
　　 實驗動物的分組同第二部分。
　　 （二）實驗處理
　　 1、實驗干預8周后，有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響具體的檢測方法及條件同第二部分。
　　 2、免疫印跡法測量2型糖尿病大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白水平:
　　 (1)組織勻漿
　　 干預8周后，處死各組大鼠，取適量右側大腿的比目魚肌100mg，按

10、1∶9稀釋成1％的組織勻漿待測。
　　 (2)蛋白含量的測定(BCA法蛋白濃度測定)
　　 根據樣品的數量，按BCA法蛋白濃度測定樣品中目的蛋白的含量，測定A562吸光度，根據標準曲線計算出蛋白濃度。
　　 (3) Western Blotting
　　 抽提的蛋白經過蛋白定量后，進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為:80V*30min，待Marker完全分開后，轉為120V。
　　 蛋白轉入PV

11、DF膜，將PVDF膜與X射線片一同放入暗合盒內爆光，待顯色后即可照相，照片經掃描后應用圖像分析軟件進行分析。
　　 3、免疫組織化學染色(SP法)測量骨骼肌中GLUT4蛋白表達:
　　 (1)組織切片制備
　　 適量右側大腿的比目魚肌用4％多聚甲醛固定固定，20％蔗糖沉降過夜(4℃)，OCT包埋后用冰凍切片機恒冷箱切片，制成15μ m的骨骼肌切片。
　　 (2)免疫組化染色
　　 將切片SP顯色，

12、蘇木素復染、封片。在多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)上，測定陽性染色面積百分比來衡量GLUT4蛋白在骨骼肌組織中的表達水平。
　　 四、數據統(tǒng)計與處理
　　 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行分析處理，血糖水平在各組間的比較利用重復測量資料的方差分析。兩組間差異采用成組設計資料的t檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗和SNK-q檢驗。實驗數據以均數±標準差(x±s)表示，以P＜0.05作為有統(tǒng)計學意義。直接利用Gene

13、 tools對Western-blotting結果進行分析。分析結果采用單因素方差分析進行統(tǒng)計處理。
　　 實驗結果：
　　 一、2型糖尿病大鼠模型的制備
　　 （一）適應性喂養(yǎng)期間大鼠一般情況
　　 大鼠精神狀態(tài)良好，糖尿病鼠專用飼料喂養(yǎng)4周后，實驗組與空白對照組相比體重(Body weight，BW)和FPG均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 （二）2型糖尿病大鼠模型建立成功

14、r>　　 建模成功后實驗組大鼠身體進行性消瘦，反應遲鈍，毛色枯黃，大便稀軟。建模成功后實驗組與空白對照組相比FPG升高（見圖4）、胰島素分泌高峰延遲，HOMA-IR及AUCi均明顯高于空白對照組，具有統(tǒng)計學差異，說明實驗組大鼠存在胰島素抵抗，符合2型糖尿病的發(fā)病特點。
　　 二、有機鍺聯合鹽酸二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響
　　 （一）2型糖尿病大鼠模型干預8周后，各組大鼠的FPG及GSP的變化
　　

15、2型糖尿病大鼠模型干預8周后，測其各組大鼠的FPG，結果如下:與空白對照組相比，實驗組大鼠血清中FPG、GSP均高于空白對照組;模型對照組與有機鍺(Ge-132)組無明顯差異(p＞0.05);二甲雙胍組和二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組FPG、GSP均低于模型對照組、有機鍺(Ge-132)組，具有統(tǒng)計學差異;二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組FPG、GSP低于二甲雙胍組，有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，說明有機鍺與二甲雙胍聯合治療2型糖

16、尿病大鼠的效果優(yōu)于單用二甲雙胍的治療效果，但是單用有機鍺不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。
　　 （二）調整干預措施后，二甲雙胍組和二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組FPG的變化
　　 在二甲雙胍組的胃飼液中加入有機鍺(Ge-132) cmc-Na混懸液20mg/kg，同時去除二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)中的有機鍺(Ge-132)后，分別于干預8周后的末次空腹血糖值做統(tǒng)計分析發(fā)現二甲雙胍組加入有機鍺(Ge-132)后與

17、8周后的末次血糖無統(tǒng)計學差異，而與二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組有統(tǒng)計學差異，重復試驗結果相同。
　　 三、有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增敏作用機制的初步探討
　　 （一）各組大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表達免疫印跡法結果
　　 利用單因素方差分析，對各組數據進行比較發(fā)現與空白對照組比較，模型對照組大鼠胞膜GLUT4表達明顯下降;與模型對照組比較，二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組、二甲雙胍組、有

18、機鍺(Ge-132)組均增加;二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組較二甲雙胍組表達增加，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 （二）、各組大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表達免疫組化法結果
　　 免疫組化染色結果以大鼠骨骼肌胞質中出現棕黃色物質為陽性，結果顯示:空白對照組大鼠骨骼肌的陽性面積百分比最大;模型對照組骨骼肌細胞膜上陽性面積百分比明顯減少;二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組陽性面積百分比接近空白對照組;而二甲雙胍組或有機鍺(Ge-

19、132)組細胞膜上陽性面積百分比僅部分增加。免疫組織化學方法所得結果與免疫印跡一致。
　　 結論：
　　 本實驗通過高糖高脂飲食誘導聯合小劑量腹腔注射STZ成功制備2型糖尿病動物模型，經過觀察有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病大鼠治療的影響以及骨骼肌中GLUT4蛋白表達免疫印跡法和免疫組化法的檢測結果，初步探討了有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增敏效果的機制。主要結論如下:
　　 （一）有機鍺聯合鹽酸二

20、甲雙胍對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響
　　 1、2型糖尿病大鼠模型干預8周后，測其各組大鼠的FPG，結果有機鍺(Ge-132)與二甲雙胍聯合治療2型糖尿病大鼠的效果優(yōu)于單用二甲雙胍的治療效果，但是單用有機鍺不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。調整干預措施后，二甲雙胍組和二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組FPG的變化，也說明有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增效作用。
　　 （二）各組大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表達結果

21、
　　 利用單因素方差分析，對各組數據進行比較發(fā)現與空白對照組比較，模型對照組大鼠胞膜GLUT4表達明顯下降;與模型對照組比較，二甲雙胍+有機鍺（Ge-132）組和二甲雙胍組的胞膜GLUT4表達增加;二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組較二甲雙胍組增加。
　　 免疫組化染色結果顯示:空白對照組大鼠骨骼肌的細胞膜上GLUT4廣泛分布;模型對照組骨骼肌細胞膜上GLUT4表達明顯減少;二甲雙胍+有機鍺(Ge-132)組GLUT4

22、的表達接近空白對照組;而二甲雙胍組或有機鍺(Ge-132)組細胞膜上GLUT4表達僅部分增加。免疫組織化學方法所得結果與免疫印跡一致。
　　 綜上所述，通過對2型糖尿病大鼠的FPG、GSP以及骨骼肌中細胞膜上GLUT4的含量的表達比較，均說明有機鍺(Ge-132)與二甲雙胍聯合治療2型糖尿病大鼠的效果優(yōu)于單用二甲雙胍的治療效果，有機鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增效作用。這種增效作用可能是有機鍺(Ge-132)通過糾正糖