多西他賽pH敏感脂質(zhì)體的研究.pdf

1、癌癥一直嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，我國(guó)每年新發(fā)癌癥人數(shù)為300萬(wàn)左右，每年因癌癥死亡人數(shù)達(dá)到了270余萬(wàn)，相當(dāng)于每一天有7300余人死于癌癥。藥物療法迄今仍然是腫瘤治療的三大方法之一。
　　多西他賽(docetaxel)又稱(chēng)為多西紫杉醇，是由紫杉樹(shù)的針葉中提取的第二代紫杉烷類(lèi)化合物。它通過(guò)阻斷微管系統(tǒng)從而阻斷有絲分裂及有絲分裂間期的細(xì)胞功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。臨床上主要用于治療乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤等癌癥。多西他賽作為脂溶性藥物，

2、溶解度較低，組織特異性較差，常引起中性粒細(xì)胞減少、外周神經(jīng)毒性等毒副作用。臨床上使用的制劑通過(guò)加入吐溫-80作為增溶劑易引起超敏反應(yīng)。因此選擇合適的載藥系統(tǒng)將藥物傳輸至特定的病變部位，減少全身分布，減少給藥劑量和給藥次數(shù)，提高藥物的治療指數(shù)，降低毒副作用是目前急需解決的問(wèn)題。
　　腫瘤的靶向治療是利用具有一定特異性的載體，將抗腫瘤藥物定向地作用于腫瘤細(xì)胞，而不影響正常細(xì)胞或者組織的功能。與傳統(tǒng)細(xì)胞毒化療不同，腫瘤靶向治療具有治療指

3、數(shù)高、毒副作用小的特點(diǎn)。因此本課題制備了兩種具有良好抗腫瘤效果的多西他賽脂質(zhì)體，提高了多西他賽的溶解度和腫瘤靶向性。
　　1）多西他賽pH敏感脂質(zhì)體;
　　2）靶向因子RGD修飾的多西他賽pH敏感脂質(zhì)體。
　　pH敏感脂質(zhì)體能夠靶向低pH的腫瘤組織，發(fā)揮物理化學(xué)靶向作用，靶向因子RGD能夠靶向腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素受體，發(fā)揮主動(dòng)靶向的作用，從而提高藥物的治療效果。本文研究了兩種脂質(zhì)體的藥劑學(xué)和生物學(xué)特征，探討了其作

4、為腫瘤治療藥物的應(yīng)用前景。課題主要研究方法與結(jié)果如下:
　　1.多西他賽pH敏感脂質(zhì)體的研究
　　采用溶解-超速離心法將游離藥物與載藥脂質(zhì)體分離，建立了高效液相法測(cè)定脂質(zhì)體中多西他賽的含量及包封率。以磷脂酰乙醇胺(PE)、膽固醇(CHOL)作為主要載體材料，琥珀酸膽固醇單酯作為酸敏感材料，以多西他賽作為模型藥物。以包封率作為主要考察指標(biāo)，考察了乙醚注入法、薄膜分散法、凍融法三種制備方法，最終選擇薄膜制備法作為脂質(zhì)體的制備方法

5、。然后單因素考察了水化溫度、水化時(shí)間、藥脂比、膽固醇的量、琥珀酸膽固醇單酯(CHEMS)的量、水化轉(zhuǎn)速、旋蒸溫度因素對(duì)包封率的影響，在此基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，選用藥脂比、CHEMS的量、水化時(shí)間、水化溫度作進(jìn)行進(jìn)一步考察，得到多西他賽pH敏感脂質(zhì)體的最優(yōu)處方與最佳制備工藝:PE35mg，DTX6mg，CHOL15mg，CHEMS15mg，水化溫度為60℃，水化時(shí)間1.5h，水化轉(zhuǎn)速為800rpm，旋蒸溫度為40℃，包封率為

6、86.40％，載藥量為7.31％。
　　在最優(yōu)處方的基礎(chǔ)上，以乳糖作為凍干保護(hù)劑，采用冷凍干燥法制備凍干制劑。得到的脂質(zhì)體凍干粉末外觀(guān)均勻疏松，具有良好的再分散性。透射電鏡下觀(guān)察制備的多西他賽pH敏感脂質(zhì)體呈類(lèi)球狀，外觀(guān)圓整，邊緣清晰。動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)得多西他賽pH脂質(zhì)體粒徑為203.32±3.2nm，多分散系數(shù)PDI為0.189±0.05，Zeta電勢(shì)為-31.17±2.20mV。由穩(wěn)定性試驗(yàn)得出，所制備的脂質(zhì)體性質(zhì)較為穩(wěn)定，符合

7、制劑制備的要求。
　　2.RGD修飾的多西他賽pH敏感脂質(zhì)體的研究
　　采用多肽的固相合成將三肽RGD連接在CHEMS上，合成RGD-CHEMS，將生成的產(chǎn)物與PE、CHOL以適當(dāng)?shù)谋壤苽銻GD修飾的多西他賽pH敏感脂質(zhì)體(DTX/RGD-PLPS)。透射顯微鏡下觀(guān)察所制備的脂質(zhì)體呈類(lèi)球狀，且外觀(guān)圓整無(wú)粘連。動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)得的粒徑為221.12±1.7nm，PDI為0.194±0.07，Zeta電勢(shì)為-30.24±2.3m

8、V。
　　以多帕菲(@)作為對(duì)照，研究DTX-PLPS、DTX/RGD-PLPS在不同pH值(pH7.4、6.0、5.0、4.0)的含有0.5％吐溫-80的磷酸鹽緩沖液中的釋放特性。結(jié)果顯示與多帕菲(@)相比，藥物包載于脂質(zhì)體中后，其體外釋放時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且載藥脂質(zhì)體在酸性環(huán)境中的釋放較生理環(huán)境pH7.4快，顯示了一定的pH敏感性。
　　3.載藥脂質(zhì)體的體外抗腫瘤評(píng)價(jià)
　　本實(shí)驗(yàn)采用MTT法研究了多西他賽溶液、DTX-

9、PLPS、DTX/RGD-PLPS對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人肺癌細(xì)胞(A549)及人肝癌細(xì)胞(HepG2)的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體材料對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的存活率并無(wú)影響。相較于多西他賽溶液而言，兩種載藥脂質(zhì)體制劑的體外抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，抗腫瘤活性的強(qiáng)弱分別為DTX/RGD-PLPS＞DTX-PLPS＞DTX溶液，其半數(shù)抑制濃度IC50分別為:MCF-7:2.02±0.08、3.79±0.17、8.57±0.51μg/mL;A

10、549:2.03±0.11、2.38±0.42、6.39±3.92μg/mL;HepG2:1.65±0.05、3.12±0.15、5.04±0.62μg/mL。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種脂質(zhì)體制劑在細(xì)胞內(nèi)的攝取能力均強(qiáng)于游離的香豆素-6溶液，其中RGD修飾的脂質(zhì)體在三種細(xì)胞中的蓄積程度明顯高于未修飾組。因此我們得出脂質(zhì)體具有較好的細(xì)胞相容性，能夠?qū)⑺幬镉行У膫鬏斶M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且靶向因子RGD修飾的脂質(zhì)體具有較好的腫瘤靶向性，有望實(shí)現(xiàn)腫瘤靶

11、向治療高效低毒的目的。
　　4.載藥脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究
　　本實(shí)驗(yàn)考察了兔子耳緣靜脈注射兩種脂質(zhì)體制劑與多帕菲(@)后藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特性。結(jié)果顯示，與多帕菲(@)相比，兩種脂質(zhì)體制劑在體內(nèi)作用時(shí)間均顯著延長(zhǎng)。DAS2.0藥物動(dòng)力學(xué)軟件分析的結(jié)果顯示，三種制劑在兔子體內(nèi)均符合二室模型，且兩種脂質(zhì)體制劑DTX-PLPS、DTX/RGD-PLPS的AUC值(19.51、16.31ug/L·h)均大于多帕菲(@)的A