ALS相關(guān)突變蛋白SOD1-G93A介導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化是一種神經(jīng)變性疾病，其特征是選擇性的侵犯脊髓前角細(xì)胞、腦干后組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、皮質(zhì)錐體細(xì)胞及錐體束，導(dǎo)致上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性死亡，患者出現(xiàn)嚴(yán)重的肌無力，多數(shù)終因呼吸肌受累而死于呼吸衰竭。全世界范圍內(nèi)對ALS的研究目前主要集中于SOD1-G93A的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，所以將研究擴(kuò)展到其他模型以進(jìn)一步探討SOD1-G93A在ALS致病中的作用就具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用突變的人SOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，從氧化應(yīng)激、線

2、粒體異常改變以及細(xì)胞凋亡的角度探討SOD1-G93A對PC12細(xì)胞的影響極其可能的作用機(jī)制。為將來進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組以及轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A組。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　復(fù)蘇凍存于液氮罐中的高分化PC12細(xì)胞，以含有滅活的胎牛血清及青鏈霉素的10％高糖DMEM作為培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇傳

3、代3次以后，待突起明顯、形態(tài)規(guī)則、融合密度為80％時(shí)，取對數(shù)生長期分別轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A質(zhì)粒、空質(zhì)粒至PC12細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格遵守LipofectamineTM2000試劑說明書的操作規(guī)范。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞樣本用于實(shí)驗(yàn)研究。
　　3、丙二醛檢測
　　收集并裂解細(xì)胞，使用硫代巴比妥酸(TBARS)法測定細(xì)胞MDA水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，在532nm波長處讀取樣本吸光度。
　　4、蛋白質(zhì)免疫印跡

4、
　　提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。以30ug蛋白為上樣量，進(jìn)行鈉十二烷基的硫酸鹽(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜與一抗在4℃搖床下孵育過夜。次日再與結(jié)合有熒光染料的二抗孵育。Odyssey紅外圖像掃描系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描以確定目的蛋白的表達(dá)水平。
　　5、細(xì)胞凋亡率測定
　　消化貼壁的PC12細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心

5、去上清以后加入PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1-5×105個(gè)細(xì)胞離心去上清，加入500ullxBindingbuffer重懸細(xì)胞，加入10ulPI，室溫避光孵育5min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　6、活細(xì)胞線粒體觀測
　　用移液器沿側(cè)壁小心去除激光共聚焦顯微鏡專用玻底培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃溫浴的D-Hank's洗兩遍，加入1ml不含酚紅和抗生素的DMEM培養(yǎng)基，按線粒體染色劑(mitoredtracker)/培養(yǎng)基為1

6、∶1000的比例，加入線粒體染色劑，輕輕混勻，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育45分鐘。15分鐘后以1∶500的比例加入核染色劑Hoechst，培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。孵育完畢后去除培養(yǎng)液，D-Hank's洗一遍，加入不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基，拿出培養(yǎng)室進(jìn)行confocal觀測。
　　結(jié)果:
　　1、成功的培養(yǎng)PC12細(xì)胞并完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　倒置熒光顯微鏡顯微鏡下觀察，我們培養(yǎng)的PC12細(xì)胞貼壁良好形態(tài)規(guī)則，突起明顯;

7、SOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，蛋白質(zhì)免疫印跡法在對應(yīng)位置檢測到含有EGFP標(biāo)簽的外源性SOD1，流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率為20.1％。
　　2、丙二醛水平測定
　　MDA含量代表了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，可間接反映氧化應(yīng)激水平。轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞蛋白測定MDA，結(jié)果顯示SOD1-G93A組MDA值明顯高于對照組(p＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A引發(fā)了PC12細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。
　　3、血紅素

8、氧合酶1表達(dá)水平測定
　　HO-1是體內(nèi)重要的抗氧化酶，在多種刺激條件下可被誘導(dǎo)，比如氧化應(yīng)激。在PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A，48h后提取細(xì)胞蛋白用于蛋白質(zhì)免疫印跡，觀測血紅素氧合酶1的變化。結(jié)果顯示HO-1在轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A組相比于對照組明顯升高(p＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、細(xì)胞凋亡率
　　凋亡中、晚期細(xì)胞，細(xì)胞膜的完整性受到比較嚴(yán)重的破壞，溴化乙錠可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞核紅染，以此可較為客

9、觀地判定細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A48h后收集細(xì)胞用于凋亡率檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A組細(xì)胞凋亡率高達(dá)40.9％，正常對照組僅為9.7％。
　　5、線粒體形態(tài)改變
　　轉(zhuǎn)染48h后hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，mitored標(biāo)記線粒體，直接觀測激光共聚焦顯微鏡專用玻底培養(yǎng)皿中的活細(xì)胞。過表達(dá)SOD1-G93A組細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的線粒體碎片，且偶見巨型線粒體聚集體。
　　結(jié)論:
　　SOD1-G9