氯氰菊酯的雄性生殖毒性效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是環(huán)境與生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥屬于EDCs，是一類高效、廣譜的殺蟲(chóng)劑，其使用量?jī)H次于有機(jī)磷農(nóng)藥。氯氰菊酯(cypermethrin, CYP)是合成擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)及其他領(lǐng)域。近年來(lái)，一些學(xué)者報(bào)道CYP的長(zhǎng)期攝入可對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響，如睪丸損傷、精子數(shù)量減少、精子活力改變、精子形態(tài)異常及遺傳毒性。但其作用機(jī)制較為復(fù)雜，可能與雄激素受體(AR)介導(dǎo)的信號(hào)通路有

2、關(guān)。
　　 本研究首先應(yīng)用美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)推薦的研究EDCs的雄性生殖毒性和抗雄激素活性的體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)，即成年雄性嚙齒類動(dòng)物15天染毒實(shí)驗(yàn)，對(duì)成年雄性SD大鼠灌胃染毒15天，觀察CYP對(duì)大鼠生殖器官臟器系數(shù)、精子頭計(jì)數(shù)、激素活力、生殖細(xì)胞的毒性及AR表達(dá)的影響。同時(shí)利用受體報(bào)告基因、哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)等體外（in vitro）實(shí)驗(yàn)研究CYP的雄性生殖毒性機(jī)制。為揭示擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的雄性生殖毒性效應(yīng)及其機(jī)制

3、提供重要依據(jù)，并為其他化學(xué)物質(zhì)的研究提供新的思路和技術(shù)平臺(tái)。
　　 第一部分氯氰菊酯對(duì)成年雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響
　　 目的：研究CYP對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷，闡明其與AR表達(dá)的關(guān)系，為揭示擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的雄性生殖毒性效應(yīng)及其機(jī)制提供依據(jù)。
　　 方法：選擇成年雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為五組（對(duì)照組、6.25、12.5、25和50mg-kg-1·day-1組）。灌胃染毒15天后處死大鼠，分離睪丸，稱重，一側(cè)用于

4、精子頭計(jì)數(shù)，另一側(cè)用于普通病理、免疫組化檢測(cè)及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察；同時(shí)取全血離心后測(cè)血清中生殖激素水平。
　　 結(jié)果：12.5和25mg·kg-1·day-1組睪丸臟器系數(shù)增加，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。50mg·kg-1·day-1組睪丸每日精子生成量減少，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。染毒組曲細(xì)精管變形、皺縮，出現(xiàn)壞死管腔伴隨細(xì)胞層數(shù)減少，6.25mg·kg-1·day-1組單位面積內(nèi)曲細(xì)精

5、管的個(gè)數(shù)顯著減少(P＜0.05);各染毒組曲細(xì)精管的周長(zhǎng)與對(duì)照組比較明顯減小(P＜0.05);6.25和12.5mg·kg-1·day-1組曲細(xì)精管的內(nèi)腔較對(duì)照組小(P＜0.05)。同時(shí)，生精上皮的細(xì)胞層數(shù)與對(duì)照組比較，12.5、25和50mg·kg-1·day-1組顯著減少(P＜0.01)。電鏡下觀察，染毒低劑量組可見(jiàn)細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體腫脹，支持細(xì)胞緊密連接打開(kāi)。染毒高劑量組可見(jiàn)精細(xì)胞形成受阻、精子頭部空泡形成、尾部線粒

6、體排列紊亂伴隨壞死和凋亡小體。免疫組化實(shí)驗(yàn)中AR表達(dá)在12.5、25、50mg·kg-1·day-1組明顯減少(P＜0.01)。血清中LH的水平隨著染毒劑量的增加而升高，且與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：CYP可能對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生不同程度的損傷。而AR表達(dá)受抑制可能是CYP引起雄性生殖毒性的重要機(jī)制之一。
　　 第二部分氯氰菊酯雄性生殖毒性效應(yīng)的機(jī)制研究
　　 目的：通過(guò)

7、AR報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)研究CYP雄性生殖毒性的作用機(jī)制。
　　 方法：建立以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)為報(bào)告基因的AR報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)與哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)。將表達(dá)AR的質(zhì)粒AR/pcDNA3.1、重組報(bào)告基因質(zhì)粒pMMTV-CAT和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pSV-β-Gal共轉(zhuǎn)染非洲猴腎細(xì)胞株CV-1，研究CYP是否與內(nèi)源性雄激素5α-DHT競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AR。將表達(dá)AR氨基端質(zhì)粒AR-pVP16-NH2、表達(dá)AR羧基端質(zhì)粒AR-PM-

8、COOH和報(bào)告基因質(zhì)粒PG5-CAT共轉(zhuǎn)染非洲猴腎細(xì)胞株CV-1, CV-1轉(zhuǎn)染后用CYP染毒，通過(guò)檢測(cè)該物質(zhì)作用下CAT的蛋白表達(dá)水平，研究CYP是否抑制NH2/COOH端相互作用。
　　 結(jié)果：CYP在10-7M-10-5M濃度范圍內(nèi)顯著拮抗0.5nM的5α-DHT誘導(dǎo)的CAT的表達(dá)，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為6.80×10-5M。CYP在10-7M-10-5M濃度范圍內(nèi)影響NH2/COOH端相互作用，使CAT的表達(dá)量降低