腎綜合征出血熱患者不同臨床階段NK細(xì)胞及其相關(guān)表面標(biāo)志物的研究.pdf

1、前言
　　腎綜合征出血熱(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是由漢坦病毒引起的一種歷史悠久、流行廣泛、危害性嚴(yán)重的自然疫源性疾病。該病的主要臨床特征有發(fā)熱、出血和腎損害，其病理改變包括微血管出血、急性血小板減少、低血壓休克以及腎衰竭等。目前，我國(guó)HFRS的發(fā)病率和病死率仍居世界首位，是重災(zāi)區(qū)。HFRS具有如此高的發(fā)病率及病死率，但發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。在漢坦病毒的感染中，免疫細(xì)胞及其表面

2、相關(guān)標(biāo)志物的研究不容忽視。
　　病毒感染人體后能導(dǎo)致感染細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的損害，另一方面也能誘發(fā)人體的免疫應(yīng)答和各種細(xì)胞因子的釋放。自然殺傷細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要組成部分，免疫反應(yīng)中可顯著地發(fā)揮抗病毒作用。NK細(xì)胞是一群CD3表達(dá)陰性、CD56表達(dá)陽性或CD16表達(dá)陽性的淋巴細(xì)胞，具有較強(qiáng)的殺傷功能和免疫調(diào)節(jié)功能。NK細(xì)胞表面受體包括殺傷抑制受體和活化受體。這些受體能夠與靶細(xì)胞表面相應(yīng)的配體相結(jié)合而產(chǎn)生抑制信號(hào)或活化信號(hào)，決定著N

3、K細(xì)胞是否對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能。
　　CD8+T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的效應(yīng)T細(xì)胞，經(jīng)抗原致敏后可以特異性殺傷攜帶致敏抗原的靶細(xì)胞，通過其表面的受體TCR和CD8分子同抗原提呈細(xì)胞提呈的MHC-肽復(fù)合物結(jié)合從而傳導(dǎo)活化信號(hào)，進(jìn)而對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷。同時(shí)，有研究表明，CD8+T細(xì)胞也可表達(dá)一些抑制性或活化性的NK相關(guān)受體。但目前對(duì)于HFRS患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞表面NKR的表達(dá)情況，報(bào)道較少。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)HFRS患者不同臨床

4、階段NK細(xì)胞亞群的精細(xì)劃分、特定NK細(xì)胞亞群表面受體的表達(dá)，HFRS患者體內(nèi)CD8+T表面NKR的表達(dá)情況進(jìn)行深入研究，以期為闡明HFRS患者的免疫機(jī)制、尋找有效地疾病防御防控措施提供依據(jù)。
　　方法
　　一、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集
　　按照2008年修訂的“全國(guó)流行性出血熱防治方案”(WS278-2008)中臨床診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)，所有病例經(jīng)特異性HFRS—IgM、IgG檢查均為陽性，臨床表現(xiàn)典型。陰性的健康對(duì)照者來自健康體檢門診

5、和實(shí)驗(yàn)室工作人員，血常規(guī)、肝、腎功能正常，無免疫系統(tǒng)疾病史。在患者知情并同意的情況下抽取外周血5ML肝素鈉抗凝。同時(shí)對(duì)健康人群以同樣的方法取血作對(duì)照。
　　二、淋巴細(xì)胞分離
　　1)取5ml抗凝全血與5mlPBS緩沖液，加入10ml人淋巴細(xì)胞分離液離心20分鐘，取中間白色云霧狀狹窄層（PBMC層），放入4-5mlPBS緩沖液的試管中，離心10分鐘。吸去上清液，沉淀經(jīng)過反復(fù)洗滌2次即得所需淋巴細(xì)胞。
　　2)將分離淋巴細(xì)

6、胞置于液氮罐中保存以備后續(xù)分析。
　　三、細(xì)胞復(fù)蘇
　　從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40度水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化，將細(xì)胞懸液移入離心管中，緩慢加入1640培養(yǎng)液，離心兩次，去除二甲基亞砜。
　　四、細(xì)胞表面染色
　　向流式細(xì)胞儀專用試管中加入0.1mlPBMC懸液，按照BD公司細(xì)胞表面染色試劑盒說明書操作分別加入相應(yīng)的抗體，并設(shè)立單標(biāo)管與陰性對(duì)照管。染色半個(gè)小時(shí)后加每管加入2mlPBS緩沖液進(jìn)

7、行洗滌，離心10分鐘，用緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　五、流式細(xì)胞檢測(cè)
　　為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，檢測(cè)機(jī)器的準(zhǔn)確性，然后再對(duì)之前制備好的樣本進(jìn)行測(cè)定，用流式分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。樣本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、HFRS患者NK細(xì)胞變化
　　HFRS患者的NK細(xì)胞水平明顯高于正常對(duì)照組，并

8、且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)四個(gè)不同臨床發(fā)病階段的患者同正常對(duì)照組進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，在四個(gè)發(fā)病階段內(nèi)兩種細(xì)胞水平也都處于升高狀態(tài)，且少尿期高于發(fā)病初期與末期。
　　二、HFRS患者NK細(xì)胞活化與抑制受體表達(dá)變化
　　對(duì)NK細(xì)胞抑制受體NKG2A和活化受體NKG2D進(jìn)行了分析。結(jié)果患者抑制受體NKG2A表達(dá)總水平有下降趨勢(shì)，并且在少尿期下降的比較明顯。但是NK細(xì)胞活化受體NKG2D表達(dá)有上升的趨勢(shì)。對(duì)不同發(fā)病階段患者活化受體表達(dá)進(jìn)行比

9、較發(fā)現(xiàn)少尿期略有升高。
　　三、HFRS患者NK細(xì)胞亞群變化
　　對(duì)HFRS患者NK細(xì)胞的3個(gè)NK細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有患者的CD56-CD16+和CD56briCD16-/+NK亞群細(xì)胞數(shù)量顯著高于正常對(duì)照組，并且在都少尿期升高明顯，而CD56dimCD16+細(xì)胞NK亞群沒有明顯的變化。對(duì)各期變化趨勢(shì)進(jìn)行分析時(shí)，結(jié)果同樣是沒有差異。
　　四、HFRS患者CD8+T細(xì)胞以及其表面表達(dá)NK受體的變化
　　首先選

10、取標(biāo)記CD3+的T淋巴細(xì)胞，再定義出CD3+CD8+T細(xì)胞，結(jié)果為患者CD8+T細(xì)胞整體水平顯著升高，整個(gè)病程中的CD8+T細(xì)胞水平升高的都很明顯。但是HFRS患者與正常對(duì)照CD8+T細(xì)胞表達(dá)NK受體(活化受體NKG2D和抑制受體NKG2A)并沒有太大的差異。
　　結(jié)論
　　HFRS患者NK細(xì)胞數(shù)量在疾病的發(fā)熱期和少尿期顯著增加。NK細(xì)胞活化受體NKG2D表達(dá)量總體水平上升，抑制受體NKG2A表達(dá)下降，在少尿期最少。NK細(xì)胞