褪黑素受體基因1B和1A基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分褪黑素受體基因1B基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征相關(guān)性研究
　　 研究背景:多囊卵巢綜合征(PCOS)是青春期及育齡期婦女最常見的高度異質(zhì)性的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病。其臨床表現(xiàn)具有多樣性和復(fù)雜性的特點。典型的表現(xiàn)包括不同程度的月經(jīng)異常，以月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)為主；卵巢多囊性改變；高雄激素血癥，多毛、痤瘡、肥胖；以及隨著年齡增長而日趨明顯的胰島素抵抗和或高胰島素血癥和高脂血癥等。PCOS常合并2型糖尿病和心血管疾病。多方面的研究結(jié)果顯

2、示，該病可能是由多個基因異常和多種環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。PCOS存在明顯家族聚集傾向也提示遺傳因素在其病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。PCOS與2型糖尿病都屬于多基因遺傳病，二者具有許多共同的遺傳學(xué)特征。此外，PCOS和2型糖尿病在臨床代謝表現(xiàn)和流行病學(xué)表現(xiàn)等方面也有許多相似之處，胰島素抵抗及高胰島素血癥是2型糖尿病和PCOS發(fā)生、發(fā)展共同的病理生理基礎(chǔ)。PCOS與2型糖尿病的相似性特別是遺傳學(xué)方面的相似性提示2型糖尿病的發(fā)病相關(guān)基因

3、可能也是PCOS的相關(guān)基因，因此，研究者們常常將2型糖尿病的疾病相關(guān)基因作為PCOS的疾病相關(guān)基因研究的候選基因。
　　 褪黑素受體基因1B(MTNR1B)是最新的2型糖尿病的候選基因，它位于人類染色體11q21-q22，編碼高親和力G蛋白偶聯(lián)受體，與人類松果體分泌的激素-褪黑激素結(jié)合而發(fā)揮生理作用。褪黑激素(Melatonin)是吲哚類激素，在哺乳動物和人體內(nèi)主要由腦部松果腺分泌，其分泌受光照影響。表現(xiàn)出明顯的晝低夜高的節(jié)律變

4、化。并且動物褪黑素的分泌還能根據(jù)年光照周期的變化而變化，從而來調(diào)整內(nèi)分泌系統(tǒng)等以適應(yīng)環(huán)境變化。研究已證實生理節(jié)奏的紊亂影響機體代謝的調(diào)控，進(jìn)而增加患2型糖尿病的風(fēng)險。褪黑激素是通過與其高親和性G蛋白偶聯(lián)受體MTNR1B和MTNR1A的結(jié)合來發(fā)揮其生物學(xué)功能的。MTNR1B基因中rs10830963和rs10830962兩個SNP位點是與葡萄糖代謝和胰島β細(xì)胞功能密切相關(guān)的兩個主要的功能性多態(tài)位點，與2型糖尿病的發(fā)病具有高度的相關(guān)性。依據(jù)

5、候選基因原理，我們推測MTNR1B基因rs10830963和rs10830962位點不僅是2型糖尿病的風(fēng)險位點，同時也是PCOS疾病的相關(guān)位點。
　　 目的:通過分析比較MTNR1B基因rs10830963和rs1083096多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率在PCOS組與對照組中分布的差異，探討MTNR1B基因的變異與PCOS發(fā)病的相關(guān)性；同時比較上述多態(tài)位點不同基因型的PCOS病人的內(nèi)分泌及代謝特征表型的差別，從而研究MTN

6、R1B基因rs10830963和rs10830962不同基因型與PCOS不同臨床表型的相關(guān)性，探討MTNR1B基因在PCOS的發(fā)病及病理生理變化過程中的相關(guān)作用。
　　 研究對象:本研究依據(jù)2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)選擇在山東省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門診就診的PCOS患者526例，并選擇同期就診的547例正常女性作為對照。所有研究對象均為中國山東漢族人且無親緣關(guān)系。
　　 研究方法:測定研究對象相應(yīng)的激素水平，包括卵泡刺激素(FS

7、H)、黃體生成素(LH)、催乳素(PRL)、雄激素(T)和雌激素(E2)。血脂指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)。所有PCOS患者行OGTT試驗。抽取外周血抗凝處理后，提取全血基因組DNA?；蚍中筒捎脤崟r熒光PCR技術(shù)進(jìn)行。同時采用隨機數(shù)字法隨機抽取5％的已測樣本進(jìn)行直接測序以驗證實時熒光PCR技術(shù)分型的準(zhǔn)確性。
　　 統(tǒng)計學(xué)方法:計數(shù)資料以百分率表示，計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±S

8、D)表示。以Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗PCOS組和正常對照組的基因型分布。以Haploview4.0檢驗兩種SNP間連鎖不平衡。采用x2檢驗的方法比較PCOS組和正常對照組中基因型頻率和等位基因頻率分布的差異。病例組和對照組中臨床和生化指標(biāo)的比較采用獨立樣本t檢驗。多組、兩組均數(shù)比較用單因素方差分析及t檢驗分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行各數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。當(dāng)p<0.05時認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)果:

9、r>　　 1.SNP rs10830963位點三種基因型和兩種等位基因頻率在正常對照組與PCOS組相比較差異均有顯著性。
　　 2在SNP rs10830963位點中，PCOS組中CG和GG基因型與CC基因型相比，其OGTT葡萄糖曲線下面積顯著增高，HOMA-IR顯著增高，空腹血糖及OGTT30分鐘、60分鐘及120分鐘血糖均顯著增高，差異均有顯著性。其不同基因型PCOS婦女的內(nèi)分泌激素水平，血脂水平及年齡、體重指數(shù)比較均無顯

10、著性差異。
　　 3.SNP rs10830962位點三種基因型和兩種等位基因頻率在正常對照組與PCOS組相比較差異均無顯著性。
　　 4.SNP rs10830962不同基因型PCOS婦女的激素水平，OGTT葡萄糖曲線下面積和胰島素曲線下面積，各個時點血糖及胰島素水平、HOMA-IR及血脂水平比較均無顯著性差異，其不同基因型PCOS婦女的年齡、體重指數(shù)比較均無顯著性差異。
　　 結(jié)論:MTNR1B基因中的單核苷

11、酸多態(tài)位點rs10830963是中國漢族PCOS患者的疾病相關(guān)基因位點，并且與PCOS的臨床表型相關(guān)。MTNR1B基因中的rs10830962位點不是中國漢族PCOS患者的疾病相關(guān)基因位點。
　　 第二部分褪黑素受體基因1A基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征相關(guān)性研究
　　 研究背景:褪黑激素是哺乳動物和人類松果體腺分泌的重要的荷爾蒙激素，其最主要的生物學(xué)功能是調(diào)控生理節(jié)奏、睡眠和生殖功能。目前研究表明生理節(jié)奏的紊亂與人類代謝失

12、調(diào)性疾病密切相關(guān)，例如糖尿病和肥胖。除了調(diào)控生理節(jié)奏外，褪黑激素還具有中和活性氧和氮，激活免疫系統(tǒng)的功能。而活性氧族和細(xì)胞凋亡與人類生殖的許多環(huán)節(jié)密切相關(guān)。包括卵泡閉鎖、卵母細(xì)胞成熟、排卵和黃體形成。因此，褪黑素對卵巢功能有直接的作用。褪黑激素的功能主要由MTNR1A和MTNR1B介導(dǎo)，二者都是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。MTNR1B主要在B細(xì)胞中表達(dá)，MTNR1A主要在α細(xì)胞中表達(dá)，MTNR1A在體內(nèi)的分布較MTNR1B更為廣泛。但MT

13、NR1A與PCOS相關(guān)關(guān)系的研究國內(nèi)外尚屬空白。
　　 MTNR1A基因定位于人類染色體4q35.1，共有兩個外顯子。MTNR1A啟動子區(qū)是MTNR1A基因的主要的功能性區(qū)域，與MTNR1A的表達(dá)密切相關(guān)。Rs2119882位點位于MTNR1A基因啟動子區(qū)(-369bp)，該位點俘獲了啟動子區(qū)另外兩個多態(tài)位點(rs11721818和rs7687823)，這三個多態(tài)位點跨越了MTNR1A啟動子區(qū)6.3kb的區(qū)域，由此可見，SNP

14、rs2119882是MTNR1A基因主要的功能性多態(tài)位點。
　　 目的:本研究選取MTNR1A啟動子區(qū)SNPs rs2119882位點作為檢測位點，分析比較MTNR1A基因rs2119882多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率在PCOS組與對照組中分布的差異，以及該位點與PCOS內(nèi)分泌、糖類和脂類代謝的相關(guān)性。探討MTNR1A基因在PCOS發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 研究對象:病例組患者為2006年9月至2008年2月在山東

15、省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的PCOS患者，共481例，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)選擇。并選擇522例正常女性作為對照。所有研究對象均為中國山東漢族人且無親緣關(guān)系。
　　 研究方法:抽取外周血抗凝處理后，提取全血基因組DNA?；蚍中筒捎脤崟r熒光PCR技術(shù)進(jìn)行。為檢驗實時熒光PCR分型的準(zhǔn)確性，本研究采用隨機數(shù)字法隨機抽取5％的已測樣本進(jìn)行直接測序。
　　 同時測定研究對象相應(yīng)的激素水平，包括卵泡刺激素(FSH)、黃體

16、生成素(LH)、催乳素(PRL)、雄激素(T)和雌激素(E2).血脂指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)。所有PCOS患者行0GTT試驗。
　　 統(tǒng)計學(xué)方法:計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示，數(shù)據(jù)資料進(jìn)行必要的對數(shù)轉(zhuǎn)換以使數(shù)據(jù)的分布符合正態(tài)分布。Hardy-weinberg遺傳平衡定律檢驗采用x2檢驗的方法進(jìn)行。病例組和對照組中臨床和生化指標(biāo)的比較采用獨立樣本t檢驗。多組、兩組均數(shù)

17、比較用單因素方差分析及t檢驗分析。率的比較采用x2檢驗。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。當(dāng)P<0.05時有顯著差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.在正常對照組中SNP rs2119882位點CC、CT和TT三種基因型頻率分別為13.60％(71/522)、45.21％(236/522)和41.19％(215/522)，在PCOS組中三種基因型頻率分別為20.58％(99/481)、44.70％(215/48

18、1)和34.72％(167/481)。三種基因型頻率在兩組中比較差異有顯著性。并且SNP rs2119882位點C等位基因頻率在PCOS組中顯著高于正常對照組，差異有顯著性。
　　 2.在SNP rs2119882位點中，PCOS組中CC和CT基因型與CC基因型相比，其HOMA-IR顯著增高，空腹血糖及OGTT0分鐘、30分鐘，60分鐘及120分鐘胰島素水平均增高，差異均有顯著性。其不同基因型PCOS婦女的內(nèi)分泌激素水平，血脂水