氨負(fù)荷下肝硬化大鼠模型水通道蛋白-4mRNA及蛋白的表達(dá)與腦水腫關(guān)系的研究.pdf

1、目的： 肝硬化及終末期肝病患者通常存在不同程度的腦水腫，血氨的升高促進(jìn)了肝性腦病的發(fā)生。腦水腫使顱內(nèi)壓升高，二者的惡性循環(huán)使患者預(yù)后不佳。而目前，臨床對其治療非常有限。水通道蛋白(AQP)是膜水通道蛋白家族，為調(diào)節(jié)細(xì)胞水平衡的選擇性孔道，其中AQP-4在大腦中分布廣泛，它在腦內(nèi)的研究成為近年來的研究熱點(diǎn)，增加對其了解可能為臨床腦水腫的治療提供新的方案。本研究擬應(yīng)用肝硬化動物模型，給予氨負(fù)荷，研究水通道蛋白-4mRNA及蛋白的表達(dá)

2、與腦水腫的關(guān)系。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)動物為健康雄性(SD)大鼠，隨機(jī)分為4組：(1)正常組：不加外界干預(yù)因素；(2)正常氨負(fù)荷組：實(shí)驗(yàn)?zāi)┙o予氨負(fù)荷；(3)肝硬化組：腹腔注射四氯化碳橄欖油溶液制備肝硬化動物模型，注藥時(shí)間為12周，實(shí)驗(yàn)?zāi)┎患油饨绺深A(yù)因素；(4)肝硬化氨負(fù)荷組：制備肝硬化模型，方法同肝硬化組，實(shí)驗(yàn)?zāi)┙o予氨負(fù)荷。 1、血氨的檢測：各組大鼠在給予氨負(fù)荷前及氨負(fù)荷30分鐘后分別經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血1ml，并在半小

3、時(shí)內(nèi)應(yīng)用vitors AMON干片比色法測定血氨值。 2、血腦屏障通透性的檢測：處死動物前2小時(shí)尾靜脈注射伊文思藍(lán)溶液，取腦組織溶于甲酰胺，離心取上清液于波長632nm進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出腦組織EB含量，以此評價(jià)BBB通透性的變化。 3、腦水含量的檢測：處死大鼠后，完整取出腦組織，干濕重法檢測腦水含量。 4、HE染色觀察肝、腦組織切片：2小時(shí)后處死大鼠，立即取大腦及肝右葉組織，應(yīng)用4％多聚甲醛固定。常規(guī)H

4、E染色，顯微鏡下觀察肝臟和腦組織情況。 5、RT-PCR方法檢測AQP-4 mRNA表達(dá)：總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物電泳。 6、免疫組化法檢測腦組織AQP-4蛋白：取材、固定、組織塊脫水透明、石蠟包埋、切片、染色、封片。 7、所有數(shù)據(jù)均以-x±s表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析，p值小于0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、肝硬化氨負(fù)荷組中5只大鼠角膜反射與翻

5、轉(zhuǎn)反射消失；正常組、正常氨負(fù)荷組及肝硬化組角膜反射與翻轉(zhuǎn)反射存在。肝硬化組4只大鼠有腹水生成，肝硬化氨負(fù)荷組6只大鼠有腹水生成。顯微鏡下觀察：肝硬化組及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生，有明顯硬化結(jié)節(jié)形成，而正常組及正常氨負(fù)荷組未見上述表現(xiàn)。四組大鼠腦組織大體標(biāo)本未見異常。 2、血氨檢測結(jié)果：給藥前，肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠與正常組及正常氨負(fù)荷組大鼠相比，血氨水平明顯升高，經(jīng)檢驗(yàn)P＜0.05；給藥后，肝硬化氨負(fù)荷

6、組血氨進(jìn)一步升高，分別與其他三組相比，P＜0.05；肝硬化組血氨水平仍高于正常組及正常氨負(fù)荷組，經(jīng)檢驗(yàn)P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常組與正常氨負(fù)荷組相比，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3、血腦屏障通透性及腦水含量檢測結(jié)果：肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦內(nèi)EB含量分別與正常組、正常氨負(fù)荷組及肝硬化組相比顯著增高，最高值達(dá)到1.9890 ug/g，經(jīng)檢驗(yàn)P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；其他三組間經(jīng)比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝硬化組及肝硬

7、化氨負(fù)荷組大鼠腦內(nèi)水含量分別與正常組、正常氨負(fù)荷組相比明顯增高，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦內(nèi)水含量與肝硬化組相比，P＜0.05，亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常組與正常氨負(fù)荷組相比，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4、AQP-4mRNA及蛋白表達(dá)檢測結(jié)果：肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組可見清晰電泳條帶，正常組及正常氨負(fù)荷組電泳條帶模糊不清。肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦組織AQP-4mRNA積分光密度(ID)的表達(dá)顯著高于正常組

8、及正常氨負(fù)荷組，這兩組分別與正常組及正常氨負(fù)荷組相比，P＜0.05，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；肝硬化氨負(fù)荷組大鼠AQP-4mRNA積分光密度最高值達(dá)1.5100，高于肝硬化組，兩組相比P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常組與正常氨負(fù)荷組相比，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。四組大鼠腦組織免疫組化染色均可見AQP-4表達(dá)。肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦組織AQP-4較正常組及正常氨負(fù)荷組染色強(qiáng)度深，染色面積大。經(jīng)灰度值測定后可發(fā)現(xiàn)：肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組灰度

9、值明顯低于正常組及正常氨負(fù)荷組，肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組與正常組及正常氨負(fù)荷組相比，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；肝硬化氨負(fù)荷組大鼠灰度值低于肝硬化組，兩組相比P<0.05，亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常組與正常氨負(fù)荷組相比，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1、腹腔注射四氯化碳橄欖油溶液可制備肝硬化動物模型。 2、肝硬化動物模型存在氨代謝紊亂，給予高氨誘導(dǎo)后，血氨水平進(jìn)一步升高，提示血氨可能在肝性腦病的發(fā)生中起重要作用。