胃旁路術(shù)后脂聯(lián)素對2型糖尿病大鼠血糖控制及對胰島凋亡影響的實驗研究.pdf

1、前言：2型糖尿病(T2DM)是包括遺傳及環(huán)境等多種因素相互作用的結(jié)果。傳統(tǒng)的藥物及胰島素治療不能延緩糖尿病并發(fā)癥出現(xiàn)的時間及疾病的進程。
　　 Walter首次發(fā)現(xiàn)減肥手術(shù)可以治療糖尿病這一現(xiàn)象。據(jù)Wickremesekera報道T2DM血糖可在術(shù)后幾天至幾周內(nèi)緩解。RYGB是一種減肥手術(shù),其中繞過了80-90％的胃體,患者將減少60-90％額外的體重和獲得良好的血糖控制,這種作用可以維持15年以上。
　　 既往認為胃容

2、積減少及營養(yǎng)吸收不良引起體重減輕對血糖控制起到重要作用,但是營養(yǎng)不良的指標如白蛋白、前白蛋白糞內(nèi)脂類并未增加。一些研究表明在體重有效減輕之前T2DM已得到有效控制。目前認為體重減輕和血糖控制與體內(nèi)內(nèi)分泌激素變化有關(guān),RYGB術(shù)后觀察到胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、肽YY(PYY)、脂聯(lián)素、ghrelin等均升高。然而,該手術(shù)降糖及控制體重的確切機制尚未完全清楚。
　　 脂聯(lián)素由脂肪細胞產(chǎn)生和分泌,具有減輕胰島素抵抗、抗動脈粥

3、樣硬化、抗炎等多種生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和受體2(AdipoR2)均在胰島細胞中表達,并以AdipoR1表達為主。研究表明在中心性肥胖及T2DM中脂聯(lián)素水平下降。脂聯(lián)素水平與HOMA-IR值、總膽固醇水平、低密度脂蛋白、甘油三酯、血壓、BMI成負相關(guān)。脂聯(lián)素轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)出胰島素抵抗緩解和抗動脈粥樣硬化作用。脂聯(lián)素基因敲除小鼠表現(xiàn)出高血糖,注射脂聯(lián)素后可消除高血糖并呈劑量依賴關(guān)系。
　　 RYGB在控制

4、血糖機制方面沒有完全闡述清楚。本研究目的在于觀測RYGB是否具有減少胰島細胞凋亡的作用及脂聯(lián)素在RYGB手術(shù)中所起的降糖作用。目前脂聯(lián)素是否影響胰島素分泌及對高糖誘導(dǎo)的胰島B細胞凋亡是否具有保護作用存在爭議,RIN-m5f細胞系是能夠分泌胰島素的小鼠胰島細胞系,本研究應(yīng)用RIN-m5f細胞系觀察脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)是否具有促進胰島素分泌作用,對高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡是否有保護作用,并解釋其分子機制。
　　 材料及方法：

5、　　 一、動物實驗
　　 (一)20只10周齡雄性Goto-Kakizaki(GK)大鼠(一種自發(fā)糖尿病鼠),隨機分到RYGB組(10)和GK組(10)。10周齡Wistar大鼠分配到WS組(10)。飼養(yǎng)環(huán)境室溫26±1℃,相對濕度45％,自然光照明,術(shù)前至少10天單籠飼養(yǎng)。
　　 (二)RYGB組動物行胃旁路手術(shù),保留賁門附近約20％胃體,保留迷走神經(jīng),距Treitz韌帶10cm斷空腸,遠端上提與殘胃吻合,距吻合口1

6、0cm行空腸近端與空腸端側(cè)吻合。GK組及WS組大鼠為假手術(shù)組,胃前壁切開7mm切口,并原位縫合。控制手術(shù)時間與RYGB組相同。
　　 (三)檢測
　　 1、術(shù)前3天、術(shù)后7、14、21、28天測定動物體重及每100克體重攝食量。
　　 2、術(shù)前、術(shù)后30天各測定空腹血糖(FBS)1次。
　　 3、術(shù)前2天和術(shù)后30天各測定一次OGTT。大鼠禁食12 h,一次性灌胃給予50％葡萄糖(2 g/Kg體重)。尾靜

7、脈穿刺法采血,血糖儀法測定血糖值。采血時間點分別為0、30、60、90、120 min。用血糖曲線下面積(AUC)評價OGTT。
　　 4、術(shù)前2天和術(shù)后30天分別檢測一次餐前及餐后胰島素、C-肽及脂聯(lián)素水平(ELISA)。
　　 二、細胞部分
　　 (一)Annexin V-FITC/PI雙染檢測檢測細胞凋亡將大鼠胰島細胞系RIN-m5f分為normal、glucose、A0.2、A2、A20組。分別于A0.2

8、、A2、A20組分別加入gAd至0.2、2、20μg/ml作用細胞,各組培養(yǎng)12h后,于glucose、A0.2、A2、A20組分別給予高糖至33.3mM,培養(yǎng)12h后應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡。
　　 (二)gAd對RIN.m5f細胞胰島素分泌的測定
　　 1、根據(jù)培養(yǎng)基中g(shù)Ad濃度不同,分為A0、A0.2、A2、A20μg/ml組,經(jīng)gAd作用12h后ELISA法檢測胰島素水平。
　

9、　 2、將gAd濃度調(diào)整為2μg/ml,分別于培養(yǎng)后2、6、12、24h后ELISA法檢測胰島素水平。
　　 (三)gAd對胰島素分泌影響的分子機制實驗設(shè)為正常組(C)及gAd濃度2gg/ml組(A)。將細胞培養(yǎng)12h,收集細胞,免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測胰島素、AMPK及AdipoR1及Real-timequantitative PCR測定上述指標。
　　 (四)AdipoR1 siRNA轉(zhuǎn)染后對

10、胰島素表達的影響將細胞經(jīng)siRNA AdipoR1轉(zhuǎn)染后,檢測轉(zhuǎn)染效率及免疫蛋白印跡(Westernblot)法檢測胰島素。
　　 (五)gAd對高糖誘導(dǎo)的RIN-m5f細胞凋亡的保護作用實驗設(shè)為三組:正常組(C)、高糖組(G)及gAd保護組(A)組。A組加gAd調(diào)整濃度至2μg/ml,共同培養(yǎng)12h后,在G、A組加入葡萄糖至濃度為33.3mM,12h后收集細胞W-B及Real-time quantitative PCR法檢測P

11、KC、BAD、Bcl-xL及AdipoR1。
　　 三、統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用(x)+SD表示,用SPSS11.5分析軟件處理,并應(yīng)用單因素方差分析、Studentt-test及Tukey's test處理數(shù)據(jù)。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、手術(shù)結(jié)果
　　 RYGB組大鼠術(shù)后2只吻合口梗阻死亡,GK組術(shù)后因切口感染死亡1只,WS假手術(shù)組無死亡。
　　 二、術(shù)后大鼠體重變化術(shù)前R

12、YGB、GK及WS組組間體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后1周時,術(shù)后各組大鼠體重均有不同程度降低,術(shù)后3周時體重有所增加,并維持在該水平。RYGB組降低明顯與其他兩組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。GK組術(shù)后28天時體重比WS組降低明顯,但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 三、術(shù)后攝食率的變化術(shù)前各組間攝食率無顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后RYGB組攝食率明顯下降,21天時有上升趨勢,但仍低于其他兩組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　

13、 四、術(shù)前、術(shù)后空腹血糖(FBS)的變化術(shù)前RYGB組、GK組FBS水平明顯高于WS組,差異具有顯著性(P均＜0.01)。術(shù)后30天時RYBG組FBS值已基本降至正常范圍,并與WS組無顯著性差異。
　　 五、術(shù)后口服葡萄糖耐量的變化術(shù)前RYGB組、GK組OGTT曲線下面積(area under curve,AUC)值顯著大于對照組(P均＜0.05)。術(shù)后30天時,RYGB組AUC值顯著降低,與WS組無差異顯著性。
　　

14、六、術(shù)后血漿胰島素的變化術(shù)前RYGB組、GK組大鼠基礎(chǔ)餐前血漿胰島素水平并不低于正常對照組(P＞0.05)。而餐后RYGB組及GK組大鼠血漿胰島素明顯低于WS組(P＜0.01)。術(shù)后各組基礎(chǔ)血漿胰島素水平較術(shù)前無明顯下降變化,各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后RYGB組餐后胰島素與GK組相比有明顯升高。
　　 七、RYGB手術(shù)對胰島素抵抗的影響術(shù)前RYGB組、GK組HOMA-IR值均顯著高于WS組,表明術(shù)前GK大鼠存在明顯的胰島素抵抗,差

15、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。術(shù)后RYGB組HOMA-IR值明顯降低,并與WS組HOMA-IR值無明顯差異(P＞0.05),而該兩組HOMA-IR值明顯低于WS組,有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 八、血漿C-肽測定術(shù)前RYGB組、GK組C-肽值顯著低于對照組(P均＜0.01)。術(shù)后30天時,RYGB組C-肽值顯著高于GK組(P＜0.01)。
　　 九、血清脂聯(lián)素水平測定RYGB組及GK組脂聯(lián)素水平顯著低于對照組

16、。術(shù)后30天時,RYGB組脂聯(lián)素升高至正常水平,顯著高于GK組(P＜0.01)。
　　 十、術(shù)后胰島TUNEL細胞凋亡檢測術(shù)后30天時,RYGB組(2.85±0.26％)及WS組(2.92±0.21％)凋亡指數(shù)顯著低于GK組(16.38±0.45％),GK組可以看到更多的凋亡細胞。
　　 十一、透射電鏡結(jié)果GK組可以觀察到更多典型的凋亡細胞,細胞核不規(guī)則,染色質(zhì)凝集、邊聚。
　　 十二、Annexin V-FIT

17、C/PI細胞凋亡檢測glucose組凋亡指數(shù)(16.85±1.40％)明顯高于其他各組(P＜0.01)。脂聯(lián)素對高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡有保護作用,并隨著濃度增加保護作用增強。
　　 十三、gAd對RIN-m5f細胞胰島素分泌的影響隨著各組gAd濃度的增加,胰島素分泌量有所增加,各組差異有顯著性。當gAd濃度為2μg/L,隨時間的延長,胰島素分泌量增加,差異有顯著性,12h時達到高峰。
　　 十四、gAd對RIN-m5f細胞胰

18、島素分泌影響分子機制gAd作用后,Real-time quantitative PCR及W-B結(jié)果顯示:A組AdipoR1表達上調(diào),差異有顯著性;胰島素表達增加,差異有顯著性(P＜0.01),AMPK表達無明顯差異(P＞0.05)。
　　 十五、siRNAA干擾AdipoR1后對胰島素表達的影響AdipoR1 siRNA轉(zhuǎn)染后,AdipoR1表達量下降80％(P＜0.01)。胰島素表達下降為0.45±0.09(P＜0.01)。<

19、br>　　 十六、gAd對高糖誘導(dǎo)的RIN-m5f細胞凋亡的保護作用Real-time quantitative PCR及W-B結(jié)果顯示A組AdipoR1表達量較其它兩組升高。PKC在A組比C組表達量增加,而G組比A、C兩組表達量均降低。A組BAD比C、G組表達量下降,C組表達量較A組增加。Bcl-xL在A組比C組表達量增加,G組比A、C兩組表達量均降低。
　　 結(jié)論：
　　 1、RYGB具有治療T2DM作用。

20、　　 2、RYGB術(shù)后餐后胰島素升高是良好控制血糖的原因之一。
　　 3、RYGB術(shù)后可以通過減少凋亡對T2DM胰島細胞起保護作用。
　　 4、RYGB術(shù)后升高的脂聯(lián)素可能對控制血糖及減少胰島細胞凋亡發(fā)揮重作用。
　　 5、gAd可以通過與AdipoR1結(jié)合引起胰島素分泌,并有時間及劑量依賴關(guān)系,該過程與AMPK表達無關(guān)。
　　 6、gAd對高糖引起的胰島細胞凋亡有保護作用,并有劑量依賴關(guān)系。