蛛網(wǎng)膜下腔出血腦淋巴引流途徑阻滯后腦脊液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷及機(jī)制.pdf

1、研究背景： 急性腦血管病是人類三大致死性疾病之一，其中蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的發(fā)病率僅次于腦梗塞和腦出血，位居第三位。絕大多數(shù)SAH系腦動(dòng)脈瘤破裂所致，其病死率高達(dá)25％以上，存活下來的患者約1/3因神經(jīng)功能缺損而需要依賴他人生活，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。再出血和繼發(fā)性腦缺血是導(dǎo)致SAH嚴(yán)重預(yù)后的兩個(gè)主要并發(fā)癥。目前對(duì)腦動(dòng)脈瘤的閉塞術(shù)和血管內(nèi)栓塞術(shù)取得了很大的進(jìn)步，SAH后再出血率已顯著降低，但其總體預(yù)后并沒有顯著改善。因

2、此，深入探討SAH后繼發(fā)腦缺血損傷的機(jī)制，尋找有效防治措施是改善SAH預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。 數(shù)十年來，SAH后腦部主要?jiǎng)用}血管發(fā)生痙攣和管腔狹窄，即所謂腦血管痙攣(CVS)一直是研究的焦點(diǎn)問題。研究發(fā)現(xiàn)，SAH后CVS出現(xiàn)的時(shí)程和嚴(yán)重程度與繼發(fā)性腦缺血損傷并不呈完全平行的關(guān)系。除CVS外，SAH后腦微循環(huán)痙攣和微循環(huán)調(diào)節(jié)功能異常等因素也與繼發(fā)性腦缺血的發(fā)生有關(guān)。神經(jīng)元的死亡可通過壞死(necrosis)和凋亡

3、(apoptosis)兩種不同形式發(fā)生。哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡是受Bcl-2蛋白家族、凋亡蛋白活化因子1(Apaf-1)、caspasse(胱冬肽酶)蛋白家族等調(diào)控的。 通過大分子物質(zhì)示蹤等技術(shù)在不同種屬動(dòng)物包括人類的研究已經(jīng)證實(shí)，腦內(nèi)和蛛網(wǎng)膜下腔中的大分子物質(zhì)可以被引流入顱外淋巴管和淋巴結(jié)。SAH繼發(fā)腦缺血發(fā)生后，大量血漿蛋白等大分子物質(zhì)可通過受損的血腦屏障進(jìn)入腦組織中；由細(xì)胞受損而產(chǎn)生的細(xì)胞裂解產(chǎn)物和缺血代謝瀑布產(chǎn)生的大量肽類等大

4、分子物質(zhì)在腦中急劇增加，這些大分子物質(zhì)需經(jīng)淋巴引流出顱。目前腦淋巴引流途徑對(duì)SAH繼發(fā)性腦損傷的影響尚未見離體研究。 研究目的： 1、進(jìn)一步闡明腦淋巴引流途徑在病理?xiàng)l件下對(duì)腦組織大分子物質(zhì)引流和神經(jīng)元損傷的影響。 2、探討蛛網(wǎng)膜下腔出血腦淋巴引流途徑阻滯后腦脊液對(duì)PC12細(xì)胞和原代海馬神經(jīng)元的損傷及有關(guān)機(jī)制。 研究方法： 1、選用健康成年新西蘭大白兔，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)對(duì)照組(SO)、SA

5、H組、SAH+CLB組，每組10只。采用摘除頸部淺、深淋巴結(jié)并結(jié)扎其輸入和輸出淋巴管的方法建立腦淋巴引流阻滯(CLB)模型，采用枕大池二次注血法建立SAH模型，假手術(shù)組給予枕大池注入等量生理鹽水。于第二次枕大池注血后第5天，抽取腦脊液測(cè)定總蛋白(TP)及內(nèi)皮素-1(ET-1)的含量。取新鮮大腦冰凍切片，采用TUNEL熒光標(biāo)記法檢測(cè)大腦皮層和海馬原位凋亡情況。 2、于第二次枕大池注血后第5天抽取腦脊液分別加入PC12細(xì)胞、海馬神經(jīng)

6、元培養(yǎng)基中，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(F12/DMEM培養(yǎng)基)，正常腦脊液組，SAH組，SAH+CLB組，分別于培養(yǎng)0.5h、1h、2h、4h后，檢測(cè)細(xì)胞MTT和LDH釋放率；采用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Hsp70等的表達(dá)；通過細(xì)胞骨架的免疫熒光定位檢測(cè)細(xì)胞凋亡；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]、pH值的變化。 研究結(jié)果： 1、假手術(shù)組腦脊液中TP及ET-1與正常對(duì)照組比較，

7、無顯著性差異。SAH組及SAH+CLB組腦脊液中TP及ET-1的含量較正常對(duì)照組及SO組明顯增加，且SAH+CLB組較SAH組升高明顯。 2、TUNEL法原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示SAH組和SAH+CLB組均可見大量TUNEL陽性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞多集中在大腦皮層、海馬、基底節(jié)區(qū)、脈絡(luò)叢、室管膜等部位，而以海馬、皮層更為明顯。其中SAH+CLB組表達(dá)更強(qiáng)，與SAH組比較有顯著性意義。 3、(1)MTT、LDH結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比

8、較，正常腦脊液對(duì)細(xì)胞無明顯損傷作用；SAH組和SAH+CLB組腦脊液使細(xì)胞存活率降低，LDH釋放率增加，且后者更加明顯。 (2)免疫組化結(jié)果顯示SAH組和SAH+CLB組均有Bax、Hsp70、Caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)，Bax及Caspase-3的表達(dá)量后者大于前者，且呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)。而Hsp70和Bcl-2的表達(dá)在SAH組于2h時(shí)達(dá)高峰，SAH+CLB組于1h時(shí)達(dá)高峰，并隨時(shí)間延長(zhǎng)呈一動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。 (

9、3)細(xì)胞骨架免疫熒光染色顯示，空白對(duì)照組和正常腦脊液組細(xì)胞形態(tài)完整，胞漿及突起呈纖維束狀綠染，粗細(xì)不等，胞核均質(zhì)、完整。SAH組和SAH+CLB組細(xì)胞胞漿著色較弱，突起變短甚至回縮，胞核著色不均，可見核邊聚深染，核碎裂及核小體出現(xiàn)。其中以SAH+CLB組更為明顯。 (4)流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組及正常腦脊液組幾乎檢測(cè)不到凋亡細(xì)胞，SAH+CLB組凋亡率大于SAH組，且具有顯著性差異。 (5)激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

10、顯示，空白對(duì)照組及正常腦脊液組細(xì)胞內(nèi)Ca2+、pH染色，熒光強(qiáng)度較弱，SAH組及SAH+CLB組較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)，且SAH+CLB組高于SAH組，并具有顯著性差異。 研究結(jié)論： 1、阻斷腦淋巴引流途徑能增加SAH后腦脊液TP、ET-1的濃度，并加重SAH后繼發(fā)性腦損傷。 2、阻斷腦淋巴引流途徑可以通過下調(diào)Bcl-2、Hsp70表達(dá)，上調(diào)Caspase-3、Bax表達(dá)來加重SAH腦脊液對(duì)PC12及原代培養(yǎng)海馬神