萎縮性骨不連組織差異表達(dá)的microRNA的篩選及生物學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　microRNA(miRNA)是動(dòng)植物細(xì)胞中一類長度為22-25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA。miRNA主要通過與其靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合抑制靶基因翻譯起始或直接降解靶基因mRNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)?，F(xiàn)已知miRNA參與多種生物學(xué)過程,特別是與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。萎縮性骨不連是創(chuàng)傷骨科常見且較為棘手的一類疾病,其發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前認(rèn)為成骨細(xì)胞成骨分化的異?？赡苁俏s性骨不連發(fā)生的分子機(jī)制之

2、一。大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA參與調(diào)控成骨細(xì)胞的成骨分化,而miRNA是否與萎縮性骨不連發(fā)生相關(guān)目前尚未有報(bào)道。為研究可能參與萎縮性骨不連發(fā)生的miRNA,本研究擬篩選萎縮性骨不連斷端瘢痕修復(fù)組織中差異表達(dá)的miRNA,并驗(yàn)證其中高表達(dá)的miRNA對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的影響及其機(jī)制,從而為miRNA參與萎縮性骨不連的發(fā)生提供理論依據(jù),同時(shí)也為萎縮性骨不連的診治提供新的線索。
　　方法:
　　利用ExiqonmiRCURY?LNAm

3、icroRNA芯片(11.0版)分別檢測萎縮性骨不連患者骨不連斷端瘢痕修復(fù)組織和骨折患者骨折正常愈合后內(nèi)固定鋼板周圍骨痂組織中的miRNA。利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其中高表達(dá)的miRNA加以驗(yàn)證。將MG63細(xì)胞培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)液中,利用CCK-8檢測成骨誘導(dǎo)液對(duì)MG63細(xì)胞增殖活性的影響;利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)譜;利用堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測堿性磷酸酶活性;利用茜素紅染色檢測MG63細(xì)胞體外礦化能力。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測

4、在誘導(dǎo)MG63細(xì)胞成骨分化過程中四種miRNA的表達(dá)譜。MG63細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-628-3p和miR-654-5p雙鏈RNAmimics后繼續(xù)誘導(dǎo)成骨分化,再檢測MG63細(xì)胞的成骨能力的變化。最后利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR及WesternBlot來驗(yàn)證miR-628-3p可能作用的靶基因。將miR-628-3p和siRUNX2雙鏈RNAmimics分別轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞并誘導(dǎo)其成骨分化,檢測RUNX

5、2蛋白的表達(dá)及成骨分化的表型。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組相比,萎縮性骨不連斷端瘢痕修復(fù)組織中分別有9種miRNA表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。其中的miR-149*、miR-221、miR-628-3p和miR-654-5p呈高表達(dá)并被數(shù)據(jù)庫收錄。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)這四種miRNA確實(shí)在萎縮性骨不連斷端瘢痕修復(fù)組織中高表達(dá)。
　　2.MG63細(xì)胞培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)液其成骨能力明顯增強(qiáng)并呈時(shí)間依賴性。而在這一過程中,miR-

6、149*表達(dá)無明顯變化,miR-221表達(dá)先升高再降低,而miR-628-3p和miR-654-5p表達(dá)逐漸降低并呈時(shí)間依賴性。
　　3.MG63細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-628-3p和miR-654-5p雙鏈RNAmimics后培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)液。轉(zhuǎn)染miR-628-3p組中MG63細(xì)胞成骨分化能力明顯受抑制而在轉(zhuǎn)染miR-654-5p組無明顯改變。
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測軟件microRNA.org預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證

7、實(shí),miR-628-3p可以直接作用于RUNX2的3’-UTR。miR-628-3p雙鏈RNAmimics可以顯著抑制MG63細(xì)胞內(nèi)源RUNX2mRNA和蛋白的表達(dá)。miR-628-3p和siRUNX2雙鏈RNAmimics可以抑制成骨誘導(dǎo)液增強(qiáng)的RUNX2蛋白的表達(dá),并且兩者對(duì)MG63細(xì)胞成骨分化的抑制作用相似。
　　結(jié)論:
　　綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在萎縮性骨不連患者骨不連處組織存在差異表達(dá)的miRNA,其中高表達(dá)的miR