6種miRNAs在人不同腫瘤細(xì)胞及組織中的表達(dá)差異及生物學(xué)意義.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是一類長19～25個(gè)核苷酸，內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，在物種間高度保守。miRNAs參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移過程，其突變、缺失及表達(dá)水平的異常與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　 大量關(guān)于miRNAs表達(dá)水平改變的文獻(xiàn)報(bào)道，均是基于某一種腫瘤，檢測其miRNAs表達(dá)譜的改變。本研究中，目標(biāo)miRNAs是通過查閱大量文獻(xiàn)，篩選出人類腫瘤相關(guān)miRNAs的信息，并加以對比和分析，

2、找出與人類腫瘤相關(guān)性較大，但目前研究得尚不透徹，因而具有潛在研究價(jià)值的miRNAs。本研究篩選出miR-100、miR-148a、miR-181a、miR-200a、miR-200c和miR-218等六種目標(biāo)miRNAs。其中miR-100、miR-148a、miR-181a、和miR-218在多種腫瘤中表達(dá)水平下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用。miR-200a和miR-200c同屬miR-200家族，miR-200a在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)下調(diào)，在

3、少部分腫瘤中表達(dá)上調(diào)，miR-200c在胰腺癌細(xì)胞和組織中抑制腫瘤侵襲，但促進(jìn)腫瘤增殖。因此，關(guān)于miR-200a和miR-200c在眾多腫瘤中的表達(dá)情況，其發(fā)揮癌基因還是抑癌基因的作用，仍存在爭論，需進(jìn)一步深入研究。此外，還有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-148a、miR-200c與腫瘤耐藥有關(guān)，miR-218與乳頭瘤病毒有關(guān)。
　　 real-timePCR檢測miRNAs，是目前應(yīng)用得最為廣泛的方法，其重復(fù)性好，需要的樣本量小且定量準(zhǔn)

4、確。因此，本實(shí)驗(yàn)將用real-time PCR法檢測目標(biāo)miRNAs在不同來源、不同類型腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，并在肺癌及乳腺癌組織中進(jìn)行驗(yàn)證，比較表達(dá)差異、分析生物學(xué)意義。
　　 材料與方法：
　　 一、細(xì)胞及組織標(biāo)本收集
　　 所有細(xì)胞株均為本實(shí)驗(yàn)室保存，包括27株人腫瘤細(xì)胞，2株人正常上皮細(xì)胞。乳腺癌組織收集自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一、第四醫(yī)院乳腺外科，是2009年3月至2010年12月間手術(shù)切除、病理診斷明確的

5、10例乳腺癌及其相應(yīng)的癌旁組織。肺癌組織收集自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，是2010年12月至2011年2月間手術(shù)切除、病理診斷明確的10例肺癌及其相應(yīng)癌旁組織?；颊咝g(shù)前均未接受化療及放療。
　　 二、試劑和儀器
　　 miRNA提取試劑盒購自北京百泰克公司；RT-PCR試劑和real-timePCR試劑盒購自TAKARA公司。儀器有超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、超微量核酸蛋白測定儀、PCR擴(kuò)增儀、Mx3000

6、p Real-time PCR儀、顯微鏡等。
　　 三、方法
　　 通過查閱大量文獻(xiàn)，并經(jīng)過對比分析，篩選出人類腫瘤相關(guān)的目標(biāo)miRNAs，用real-timePCR法檢測其在人不同腫瘤細(xì)胞株中、人乳腺癌組織中、人肺癌組織中的表達(dá)水平。反轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)引物由作者設(shè)計(jì)，并驗(yàn)證特異性和靈敏度。采用目前較為公認(rèn)的TargetScan、miRanda、PicTar等生物信息學(xué)軟件預(yù)測系統(tǒng)，預(yù)測目標(biāo)miRNAs作用的靶mRNAs和可能

7、的生物學(xué)功能。
　　 結(jié)果：
　　 1、目標(biāo)miRNAs在人不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異
　　 1.1與人正常支氣管上皮細(xì)胞相比，肺癌細(xì)胞中miR-181a、miR-200a和miR-218的表達(dá)水平下調(diào)。
　　 1.2與人正常乳腺上皮細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞中miR-100、miR-148a、miR-181a、miR-200a、miR-200c和miR-218的表達(dá)水平均有所下調(diào)。
　　 1.3與乳腺癌

8、細(xì)胞MCF7相比，阿霉素耐藥株MCF7/ADR中miR-148a、miR-200a、和miR-218的表達(dá)水平分別升高了14.7倍，25.8倍和1438.1倍，但仍低于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A。通過生物信息學(xué)預(yù)測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-200a和miR-218與乳腺癌耐藥蛋白BCRP的mRNA3'UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。
　　 1.4 miR-100和miR-181a在不同來源、不同類型腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平平行相關(guān)。
　　

9、2、目標(biāo)miRNAs在肺癌、乳腺癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異
　　 2.1目標(biāo)miRNAs在肺癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)
　　 2.1.1在10例肺癌旁組織中，miR-181a、miR-200a和miR-218的平均表達(dá)水平為0.381，0.371，0.291;在相應(yīng)的10例肺癌組織中，平均表達(dá)水平為0.342，0.345,0.112。。
　　 2.1.210對肺癌及癌旁組織中，miR-218在肺癌組織中的表達(dá)水平

10、低于相應(yīng)的癌旁組織(9/10)，其他目標(biāo)miRNAs表達(dá)水平未見差異
　　 2.2目標(biāo)miRNAs在乳腺癌及其相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)
　　 2.2.1在10例乳腺癌旁組織中，miR-100、miR-148a、miR-181a、miR-200a、miR-200c和miR-218的平均表達(dá)水平分別為1.705，0.747，1.302，0.710，0.899，和0.174;在相應(yīng)的10例乳腺癌組織中，平均表達(dá)水平為0.336，0

11、.758，0.477，0.916,1.157,0.059。
　　 2.2.210對乳腺癌及癌旁組織中，miR-100(8/10)，miR-181a(6/10)和miR-218(7/10)在癌組織中的表達(dá)水平低于其相應(yīng)的癌旁組織，其他目標(biāo)miRNAs表達(dá)水平未見差異。
　　 3、目標(biāo)miRNAs在腫瘤細(xì)胞及組織中表達(dá)水平的相關(guān)性分析
　　 3.1分析6種miRNAs在腫瘤細(xì)胞中的總體表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：miR-100和m

12、iR-181a在人腫瘤細(xì)胞中的總體表達(dá)水平較高，平均值分別為0.354和0.189;miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218在人腫瘤細(xì)胞中的總體表達(dá)水平較低，平均值分別為0.039，0.050，0.082和0.029。
　　 3.2比較6種miRNAs在乳腺癌及其相應(yīng)癌旁組織中的總體表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌旁組織中miR-100和miR-181a的總體表達(dá)水平較高，說明其在癌旁組織中的表達(dá)基線原本較高；

13、miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218的總體表達(dá)水平較低，尤以miR-218表達(dá)水平最低，說明其在癌旁組織中的表達(dá)基線原本較低。在乳腺癌組織中，miR-100和miR-181a與癌旁組織相比表達(dá)水平有所下調(diào)，但由于其在癌旁組織中的表達(dá)基線較高，仍然高于miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)。其中miR-218在乳腺癌旁組織中的表達(dá)水平最低，在癌組織中又

14、進(jìn)一步下降，因而遠(yuǎn)低于miR-100和miR-181a。
　　 3.3目標(biāo)miRNAs在腫瘤細(xì)胞及乳腺癌組織中總體表達(dá)水平差異及相關(guān)性：miR-100和miR-181a在乳腺癌旁組織中的基線水平較高，盡管在腫瘤細(xì)胞及乳腺癌組織中表達(dá)下降，但仍有較高的表達(dá)水平；miR-148a、miR-200a、miR-200c和miR-218在乳腺癌旁組織中的基線水平較低，所以在腫瘤細(xì)胞及乳腺癌組織中表達(dá)總體水平也較低，其中以miR-218低表

15、達(dá)最為明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、miR-218在肺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)水平均下降。
　　 2、miR-100、miR-181a和miR-218在乳腺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)水平均下降。
　　 3、miR-148a、miR-200a和miR-218在乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株中表達(dá)水平升高，但低于正常乳腺上皮細(xì)胞。miR-200a和miR-218與乳腺癌耐藥蛋白BCRP的編碼基因ABCG2的mRNA的3'UTR區(qū)存