KLK4在子宮內膜癌中的表達調控及生物學意義.pdf

1、目的：⑴檢測KLK4在正常子宮內膜、增生性子宮內膜、子宮內膜癌組織中的表達，探討其與子宮內膜癌的關系。⑵檢測KLK4在子宮內膜癌細胞株RL95-2，KLE中的表達，并以類固醇激素(雌激素、孕激素)和它莫昔芬處理細胞，探討類固醇激素對子宮內膜癌中KLK4的調控。⑶探討在子宮內膜癌細胞中雌激素調控KLK4的信號通路。⑷探討KLK4對子宮內膜癌細胞增殖和凋亡的影響及作用機制。 方法：①應用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(realtime

2、RT-PCR)，和免疫組織化學方法檢測KLK4 mRNA和蛋白在正常子宮內膜、增生性子宮內膜、子宮內膜癌組織中的表達，并比較它們之間的表達差異及其在子宮內膜癌臨床價值。②應用real-time RT-PCR和Western blot方法檢測KLK4 mRNA和蛋白在RL95-2，KLE中的表達變化，觀察不同表型子宮內膜癌細胞中KLK4對不同藥物處理后的反應。③對子宮內膜癌細胞RL95-2、KLE兩種不同ER狀態(tài)的細胞給予不同濃度的雌激素

3、(17-βE2)處理，采用real time RT-PCR及westernblot方法分別檢測兩種細胞中KLK4 mRNA的表達變化；western blot分析17-βE2處理后的兩種內膜癌細胞內MAPK/ERK1/2以及PI3K/Akt信號通路的變化，同時應用PI3K抑制劑LY294002和MAPK抑制劑U0126聯合17-βE2處理細胞后觀測兩種細胞中兩條信號通路與KLK4蛋白表達的相關性。④采用real time RT-PCR和

4、細胞免疫化學方法分別檢測兩種子宮內膜癌細胞系RL95-2和KLE細胞中KLK4的表達差異；采用RNA干擾技術，特異性敲除RL95-2中KLK4的表達，以流式細胞術分別檢測RNA干擾后子宮內膜癌細胞RL95-2的細胞周期和凋亡變化并檢測KLK4敲除后細胞周期與凋亡相關基因的表達變化。 結果：⑴KLK4 mRNA在正常子宮內膜、增生子宮內膜和子宮內膜癌組織中均有表達。KLK4 mRNA在子宮內膜癌組織中的表達水平顯著高于增生子宮內膜

5、和正常子宮內膜組織(P<0.05)。⑵KLK4蛋白在子宮內膜癌組織中的表達水平顯著高于增生性子宮內膜和正常子宮內膜組織(P<0.01)。⑶KLK4蛋白在子宮內膜癌細胞中的表達部位主要位于細胞核內，KLK4與子宮內膜癌手術病理分期無關(P=0.382)，但與組織分化程度相關(P<0.05)；在正常子宮內膜組KLK4的表達強度雖無明顯差異(P=0.253)，但在增殖期內膜中KLK4的表達有上調趨勢；KLK4表達強度與ER受體狀態(tài)無關(P=0

6、.594)。⑷real-time RT-PCR和western blot結果顯示，雌激素上調RL95-2和KLE細胞中KLK4的表達，以17-βE2濃度在10-10和10-8mol/L時上調作用最為明顯(P<0.01)，10-12mol/L濃度時上調作用與對照組無明顯差異(P>0.05)；MPA處理組顯示KLK4的下調表達，差異有顯著性(P<0.05)；TAM處理組KLK4的相對表達含量與對照組無顯著變化(P>0.05)。⑸兩種不同ER

7、受體狀態(tài)的子宮內膜癌細胞中雌激素均不同程度的上調KLK4 mRNA的表達；雌激素能激活兩種細胞中PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2信號通路，雌激素對于KLK4的上調作用被MAPK/ERK1/2信號通路抑制劑U0126阻斷，而PI3K/Akt抑制劑不能阻斷雌激素對于KLK4的表達調控。⑹子宮宮內膜癌細胞株RL95-2中KLK4表達明顯強于KLE細胞。⑺以RL95-2細胞為平臺特異性對KLK4 mRNA干擾后，流式細胞術結果顯示RL9

8、5-細胞空白組、陰性對照組及干擾組處于S期的細胞比例分別為39.26±0.69％，39.20±0.79％，23.36±0.86％和17.78±0.35％，四組比較差異有顯著性(P<0.05)；細胞周期相關基因PCNA、cyclin D1和RB明顯下調，而cyclin E無明顯變化趨勢。⑻Annexin V和PI雙染細胞凋亡檢測顯示上述四組細胞處于早期凋亡的細胞比例分別為4.67±1.31％、4.30±1.2％、14.75±2.31％和2

9、2.28±2.48％，四組比較差異有顯著性(P<0.01)，細胞凋亡抑制相關基因Bcl-2明顯下調，而作為凋亡促進基因的Bax表達上調，凋亡效應子caspase3，8活化程度增強。 結論：①KLK4在子宮內膜癌中過度表達，其定位于內膜癌細胞核內；表達強度與癌細胞的分化程度有關，與雌激素受體無關。提示KLK4對內膜癌的發(fā)生及細胞表型轉化過程有較為重要價值。②雌、孕激素對于兩種不同ER狀態(tài)的子宮內膜癌細胞株中KLK4的表達有調控作用

10、，雌激素上調作用與細胞ER狀態(tài)無關，提示雌激素可能通過非經典核內受體調控模式影響子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展。③雌激素促進了子宮內膜癌細胞株RL95-2和KLE中KLK4的表達上調，其上調途徑與ER狀態(tài)無關；雌激素調控子宮內膜癌細胞KLK4的表達是通過MAPK信號通路介導的，這是一種雌激素非ER依賴的調控模式。④KLK4特異性敲除后能促進子宮內膜癌細胞的凋亡及使子宮內膜癌的細胞周期發(fā)生阻滯，提示KLK4與子宮內膜癌細胞的凋亡和增殖相關，這種生物