KLK4在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)和對RL95-2細(xì)胞侵襲的影響研究.pdf

1、背景：
　　子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，由于癥狀出現(xiàn)較早，大多數(shù)患者能夠早期診斷，經(jīng)過手術(shù)治療后整體預(yù)后較好，但仍有部分患者出現(xiàn)手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或早期轉(zhuǎn)移，成為這部分患者預(yù)后較差的主要原因。目前已發(fā)現(xiàn)諸多和子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物，如PTEN、P53、Ki67、K-ras等，但在臨床上的應(yīng)用仍有很多局限性。
　　人組織激肽釋放酶（Kallikrein，KLK）屬于絲氨酸蛋白酶家族，

2、由KLK1-15構(gòu)成，近年來發(fā)現(xiàn)KLK家族的成員涉及腫瘤的增殖、侵襲、耐藥等多方面功能。KLK4是近些年KLK家族中研究較熱的分子，其獨(dú)特之處在于KLK4表達(dá)于細(xì)胞核，而其他的KLK家族成員表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)KLK4在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌中呈高表達(dá)，且能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，機(jī)制研究表明KLK4能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且KLK4的表達(dá)受性激素的調(diào)節(jié)。目前已有報(bào)道KLK4在子宮內(nèi)膜

3、癌中高表達(dá)，但具體的作用和機(jī)制未知。
　　子宮內(nèi)膜癌是典型的激素依賴性腫瘤，基于KLK4在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌中的作用，我們考慮KLK4在子宮內(nèi)膜癌中也可能存在一定作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們分別從KLK4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞功能的影響及可能的機(jī)制等幾個(gè)層面做了探討。
　　第一部分、KLK4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：探討KLK4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義

4、，為改善子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后提供新的思路。
　　方法：免疫組化法檢測81例子宮內(nèi)膜癌、30例不典型增生的子宮內(nèi)膜和30例正常子宮內(nèi)膜中KLK4的表達(dá)情況，收集患者臨床病理資料，結(jié)合隨訪資料做生存分析，得出KLK4的表達(dá)和子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：KLK4主要定位在細(xì)胞核，在正常內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌中的高表達(dá)率分別為30％、53%、67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）；KLK4的高表達(dá)和子宮內(nèi)膜癌的分化程

5、度及深肌層浸潤相關(guān)（P=0.021，P=0.031），與年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)；KLK4高表達(dá)組的5年無進(jìn)展生存率較低表達(dá)組更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032）。
　　結(jié)論：KLK4的高表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的分化程度和局部侵襲有關(guān)，高表達(dá)提示早期復(fù)發(fā)，有可能作為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌早期復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。
　　第二部分、KLK4在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)和雌激素對KLK4的調(diào)節(jié)作用
　　目的：探討KLK4在子宮內(nèi)膜癌

6、細(xì)胞中的表達(dá)情況及雌激素對KLK4表達(dá)的影響
　　方法：Real-time PCR及Western blot檢測KLK4mRNA及蛋白在Ishikawa、HEC-1B及RL95-2細(xì)胞中的表達(dá)。用不含雌激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)Ishkawa細(xì)胞，分別加入10-10mol/L、10-8mol/L及10-6mol/L的17-β雌二醇培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h檢測KLK4mRNA及蛋白的表達(dá)量。再以最佳作用濃度的雌激素聯(lián)合10-9mol

7、/L、10-7mol/L及10-5mol/L的雌激素受體拮抗劑ICI182,780作用于Ishkawa細(xì)胞，觀察雌激素受體拮抗劑對KLK4表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：KLK4在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度由高到低依次為HEC-1B、Ishikawa、RL95-2。雌激素能促進(jìn)Ishkawa細(xì)胞中KLK4的表達(dá)，以10-8mol/L作用48h最明顯。ICI182,780能阻斷雌激素對KLK4表達(dá)的上調(diào)作用，當(dāng)濃度為10-7mol/L時(shí)阻斷

8、效果最明顯。
　　結(jié)論：雌激素能夠上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中KLK4的表達(dá)，雌激素受體拮抗劑能阻斷雌激素對KLK4表達(dá)的上調(diào)作用。推測雌激素能夠通過雌激素受體促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中KLK4的表達(dá)。
　　第三部分、過表達(dá)KLK4對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞功能的影響
　　目的：探討KLK4在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中可能存在的作用。
　　方法：以pcDNA3.1(+)為載體構(gòu)建KLK4過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至KLK4低表達(dá)的RL95-2細(xì)胞，通過G4

9、18連續(xù)篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)KLK4的RL95-2細(xì)胞。MTT法檢測過表達(dá)KLK4對RL95-2細(xì)胞增殖的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)KLK4對RL95-2細(xì)胞體外遷移及侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建KLK4的過表達(dá)質(zhì)粒并建立穩(wěn)定過表達(dá)KLK4的細(xì)胞系。MTT實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)KLK4不能促進(jìn)RL95-2細(xì)胞的增殖，但劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示其體外遷移和侵襲能力較對照組明顯增加。
　　

10、結(jié)論：KLK4過表達(dá)能促進(jìn)RL95-2細(xì)胞的體外遷移及侵襲能力，但不能促進(jìn)其增殖。
　　第四部分、過表達(dá)KLK4促進(jìn)RL95-2細(xì)胞侵襲機(jī)制的初步研究
　　目的：初步探討過表達(dá)KLK4促進(jìn)RL95-2細(xì)胞體外侵襲的可能機(jī)制。
　　方法：Real-time PCR、Western blot及免疫熒光檢測過表達(dá)KLK4后e-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)變化。構(gòu)建e-cadherin的過表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定過表