內(nèi)源性哇巴因在妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)理中的作用研究.pdf

1、第一部分、抗哇巴因多克隆抗體的制備。 目的：制備抗哇巴因多克隆抗體。 方法：選擇6只4～5月齡、體重為2～2.5公斤雄性健康日本大耳白兔，采用過碘酸鈉氧化法偶聯(lián)Ouabain和OVA/BSA合成Ouabain-OVA和Ouabain-BSA完全抗原。利用Ouabain-BSA完全抗原免疫日本大耳白兔制備哇巴因抗血清；采用飽和硫酸銨沉淀法聯(lián)合DEAE-D52陰離子纖維素離子交換層析法純化哇巴因多克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE

2、法檢測(cè)抗體純度，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)、分裝或冷凍干燥-20℃保存?zhèn)溆谩?結(jié)果：過碘酸鈉氧化法偶聯(lián)合成的Ouabain-OVA和Ouabain-BSA完全抗原的偶聯(lián)率分別為1:14和1:18；Ouabain-BSA完全抗原免疫日本大耳白兔獲得的Ouabain抗血清經(jīng)純化后得到Ouabain多克隆抗體，其純度高，效價(jià)為1:500。 結(jié)論：過碘酸鈉氧化法合成的Ouabain-BSA完全抗原能有效免疫日本大耳白兔獲得Ouab

3、ain抗血清；序貫采用飽和硫酸銨沉淀法和DEAE-D52陰離子纖維素離子交換層析法純化Ouabain抗血清能獲得高純度、高效價(jià)的Ouabain多克隆抗體。 第二部分、內(nèi)源性哇巴因與妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性研究。 目的: 通過觀察內(nèi)源性哇巴因（EO）在不同病程妊娠期高血壓疾?。℉DCP）患者胎盤組織中的表達(dá)以及在孕婦外周血和新生兒臍血中的水平變化，證實(shí)EO在胎盤組織中的表達(dá)及其在血清中的水平與HDCP發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，并初

4、步探討胎兒-胎盤分泌EO的可能性。 方法：選擇30例正常晚期妊娠婦女為對(duì)照組，30例HDCP患者為病例組；病例組分為妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組，每組10例。采用免疫組織化學(xué)S-P法、免疫熒光組織化學(xué)染色法（IFH）觀察EO在胎盤組織的表達(dá)；采用競爭性ELISA法檢測(cè)孕婦外周血和新生兒臍血中EO的水平。 結(jié)果： ①病例組各組EO在胎盤組織的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.01），且隨著病程的加重，E

5、O的表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P<0.01）。 ②病例組孕婦外周血/新生兒臍血的EO水平顯著高于對(duì)照組，并且隨著疾病的發(fā)展，EO的含量逐漸增加（P<0.01）。 ③新生兒臍血EO水平均顯著高于產(chǎn)前孕婦外周血（P<0.01），且孕婦外周血EO水平在產(chǎn)后第三天明顯降低（P<0.01）。 結(jié)論：EO在HDCP患者胎盤組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且其表達(dá)強(qiáng)度與病程的發(fā)展呈明顯的正相關(guān)；孕婦外周血及新生兒臍血中EO水平顯著升高，與病程的發(fā)展

6、亦呈明顯的正相關(guān)，產(chǎn)后3天孕婦外周血中EO水平明顯下降。提示：EO直接參與了妊娠高血壓疾病的病理調(diào)控。 此外，本研究還顯示，各組新生兒臍血中EO水平均明顯高于孕婦外周血EO水平，提示：胎兒-胎盤單位可能分泌EO，加劇孕婦外周血EO水平的升高，共同參與妊娠高血壓疾病的病理調(diào)控過程。 第三部分、內(nèi)源性哇巴因在妊娠高血壓疾病發(fā)生發(fā)展中的病理調(diào)控機(jī)制研究。 目的: 探討EO在HDCP中的病理調(diào)控機(jī)制。 方法：選擇

7、30例正常晚期妊娠婦女為對(duì)照組，30例妊娠高血壓疾病患者為病例組；病例組分為妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組，各組10例。采用S-P法、免疫熒光組織化學(xué)染色法（IFH）觀察EO受體Na+/K+ATPase-α1 subunit(NKA-α1) 在胎盤組織中的表達(dá)，同時(shí)采用定磷法檢測(cè)孕婦外周血紅細(xì)胞Na+/K+ATPase(NKA)的活性；硝酸還原酶法、ELISA法分別檢測(cè)孕婦外周血和新生兒臍血中NO和ET-1的水平。

8、 結(jié)果： ①病例組各組EO的受體NKA-α1在胎盤組織的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，且隨著疾病的發(fā)展，表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱（P<0.01）。 ②病例組各組孕婦外周血紅細(xì)胞膜NKA活性顯著低于對(duì)照組，且隨著疾病的加重，其活性逐漸減弱（P<0.01）。 ③病例組孕婦外周血/新生兒臍血的ET-1水平顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；而NO水平明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。此外，病例組和對(duì)照組的臍血ET-1水平均顯著高于孕婦外周血

9、（P<0.01），而NO水平則明顯低于孕婦外周血（P<0.01）。 ④結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，EO的表達(dá)強(qiáng)度、孕婦外周血血清EO的水平均與NKA-α1的表達(dá)強(qiáng)度、孕婦外周血紅細(xì)胞膜NKA活性呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）；本研究同時(shí)還證實(shí)EO表達(dá)強(qiáng)度、孕婦外周血血清EO的水平均與ET-1呈正相關(guān)（P<0.01），與NO呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。 結(jié)論：EO的受體NKA的活性及其α1亞基在妊娠高血壓疾病患者胎盤組織中的表達(dá)隨著疾病的加