Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)老年性癡呆復(fù)合模型的建立及中藥干預(yù)研究.pdf

1、背景
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又稱早老性癡呆,是一種病因未明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。該病以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征。由于病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制不明,臨床尚無有效治療方法。隨著人均壽命的延長,人口老齡化發(fā)展,癡呆已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家繼心臟病、癌癥和腦卒中之后第四位死因。癡呆病人晚期喪失勞動能力,生活不能自理,心理能力急劇下降,通常在診斷后3-9年內(nèi)死于感染及其它系統(tǒng)疾病,給家庭和社會帶來沉

2、重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。作為癡呆最常見類型的阿爾茨海默病,因其發(fā)病年齡較早(可早至40歲),也稱為早老性癡呆,已經(jīng)成為全球范圍的世紀(jì)性難題。
　　 AD特征性病理改變是β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑(senile plaque)、tau蛋白異常磷酸化聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles)以及區(qū)域選擇性神經(jīng)元死亡。近年來,逐漸積累的證據(jù)顯示低聚物形式的Aβ和tau可能是阿爾茨海默病主要的罪魁禍?zhǔn)?。由于腦內(nèi)特

3、定區(qū)域的淀粉樣斑塊與認(rèn)知損害的程度相關(guān),且Aβ的蓄積是阿爾茨海默病的早期事件。有人認(rèn)為當(dāng)Aβ的產(chǎn)生與清除之間出現(xiàn)不平衡,加上肽段間的自我聚集作用,導(dǎo)致Aβ開始蓄積。這種現(xiàn)象超過一定限度,可能是AD的啟動因子。支持這種觀點者稱之為淀粉樣蛋白級聯(lián)假說("amyloid cascade hypothesi")。不斷積累的證據(jù)也顯示,Aβ具有神經(jīng)毒性。利用Aβ腦室內(nèi)或者海馬內(nèi)注射可以復(fù)制阿爾茨海默病動物模型?？芍麓笫髮W(xué)習(xí)記憶障礙,海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)

4、移酶(ChAT),活性降低等。該類模型適用于研究Aβ聚集或沉積在AD發(fā)病中的作用機(jī)制,并可作為評價藥物對AD治療作用的模型。
　　 目前已經(jīng)用于臨床治療阿爾茨海默病的藥物主要是膽堿酯酶抑制劑,正在進(jìn)行研究的還有抗Aβ的單克隆抗體、抵抗tau氧化和聚集作用的小分子試劑以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)替代療法等。同時因為中藥的成分天然,作用靶點多,對解決病因復(fù)雜的

5、疾病有獨特優(yōu)勢,相關(guān)實驗研究及臨床應(yīng)用逐漸受到重視。
　　 中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為,情志所傷、所愿不遂、肝氣郁滯是本病的重要病因和基本病機(jī)?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)研究表明,抑郁發(fā)生在老年性癡呆的各個階段,AD患者最常見的行為異常是表情淡漠、情感低落、焦慮不安、易激惹等情緒相關(guān)癥狀。因此,AD的中醫(yī)病理屬性當(dāng)屬肝氣郁滯。同時,中醫(yī)現(xiàn)代研究表明,肝郁證的主要病理基礎(chǔ)在大腦高級中樞。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是重要的細(xì)胞器之一,蛋白質(zhì)合成和修飾的場所。為

6、保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會將錯誤折疊的分子跨膜轉(zhuǎn)運到細(xì)胞漿中降解。這種機(jī)制稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解機(jī)制。體內(nèi)外研究證明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是AD發(fā)病機(jī)制之一。
　　 基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)精密的質(zhì)量控制系統(tǒng),在調(diào)控和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮極其重要的作用,其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理作用與功能狀態(tài)均具有疏通的特點,且以調(diào)和暢達(dá)為至關(guān)緊要,與中醫(yī)肝藏疏泄、調(diào)達(dá)的生理特性十分吻合,因此我們認(rèn)為,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能是肝主疏泄的亞細(xì)胞生理基礎(chǔ)?；诖?導(dǎo)師吳正

7、治教授結(jié)合傳統(tǒng)理論與現(xiàn)代分子機(jī)制研究進(jìn)展,提出老年性癡呆“肝氣郁滯-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)聯(lián)”中西醫(yī)結(jié)合病理假說,該假說的核心觀點是:肝氣郁滯是老年性癡呆的基本病機(jī),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為本病肝氣郁滯的亞細(xì)胞病理基礎(chǔ),疏肝解郁可以緩解和拮抗老年性癡呆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 目的
　　 建立Aβ25-35與D-半乳糖復(fù)合老年性癡呆模型；觀察疏肝解郁代表方劑柴胡疏肝散、補(bǔ)肝益髓中藥楮實子對Aβ25-35與D-半乳糖復(fù)合老年性癡呆模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶

8、能力及病理學(xué)改變的干預(yù)作用；探討AD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的相關(guān)發(fā)病機(jī)制,驗證肝氣郁滯-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)聯(lián)新假說。
　　 方法
　　 本研究通過雙側(cè)海馬內(nèi)腦立體定向注射Aβ25-35聯(lián)合長期皮下注射D-半乳糖的方法建立AD大鼠模型。將大鼠隨機(jī)分為5組,即正常對照組、AD模型組、假手術(shù)組、中藥1組(柴胡疏肝散)組、中藥2組(楮實子提取物)組(每組8只,共40只),見表1。通過Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠空間探索實驗逃避潛伏

9、期及定位航行試驗相關(guān)指標(biāo)的變化,比較不同處理組別間大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)改變:HE染色用以觀察病理學(xué)改變、甲苯胺藍(lán)染色用以計數(shù)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目及剛果紅染色法用以觀察各組大鼠腦組織淀粉樣蛋白沉積。采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemical,IHC)法檢測β淀粉樣肽(Aβ)、磷酸化tau蛋白表達(dá)情況,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白PERK、BiP、GADD153/CHOP的表達(dá)情況。原位末端凋亡法(TUNE

10、L)用以檢測各組海馬區(qū)細(xì)胞平均凋亡率。
　　 實驗結(jié)果用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件分析,均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對實驗數(shù)據(jù)大鼠逃避潛伏期、游泳距離、搜索時間百分比、搜索距離百分比、Aβ、tau平均陽性細(xì)胞數(shù)、BiP、PERK、GADD153/CHOP蛋白免疫組化平均灰度值、DG區(qū)平均神經(jīng)元數(shù)目、平均凋亡率,分別進(jìn)行各組間多個樣本均數(shù)比較。若方差齊性,采用單因素方差

11、分析方法(one-way ANOVA),用LSD法進(jìn)行多重比較；若方差不齊,用Welch近似方差分析法進(jìn)行檢驗,用Dunnett’s T3法進(jìn)行多重比較。
　　 結(jié)論
　　 Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖所致AD模型大鼠出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙,腦內(nèi)出現(xiàn)嗜剛果紅淀粉樣斑塊,磷酸化tau與Aβ免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多,海馬神經(jīng)元凋亡顯著增多,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達(dá)顯著增多；在柴胡疏肝散濃縮液與楮實子濃縮液的干預(yù)下,