薄片法血小板快速凝集實驗的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、迄今為止沒有可供臨床常規(guī)應(yīng)用的血小板功能檢測技術(shù)，國內(nèi)外血液中心僅通過詢問和捐血者問卷措施減少血小板功能缺陷的捐血者。血小板輸注無效的臨床發(fā)生率高達(dá)15％～40％，尚未見血小板制劑質(zhì)量或（和）功能缺陷因素占血小板輸注無效原因的統(tǒng)計報道。急需建立便捷、快速、價廉的血小板功能檢測技術(shù)用于街頭、獻(xiàn)血屋和血站血小板捐血者的快速篩查。本研究探索以新型血小板激活劑--焦性沒食子酸丙酯陽離子鹽溶液（Cationic propyl gallate，c-

2、PG）建立薄片法血小板凝集時間（Slide Platelet Clot Time，SPCT），并初步應(yīng)用于捐血人群、服用抗血小板藥物患者、血小板減少癥患者和各種血小板制品的快速篩查。
　　 第一部分 焦性沒食子酸丙酯陽離子溶液與SPCT的建立
　　 該部分主要通過選擇的c-PG濃度、比較常用血小板激活劑誘導(dǎo)血小板凝集的可視性、檢測血小板抑制劑對c-PG誘導(dǎo)的SPCT影響以及c-PG誘導(dǎo)的SPCT影響因素，優(yōu)化建立SPCT

3、。
　　 第一節(jié) c-PG濃度對其誘導(dǎo)的SPCT凝集時間的影響
　　 目的：篩選c-PG的合適濃度。方法：隨機(jī)選取健康捐血者富含血小板血漿（PRP）8份，分別以終濃度為20gM、30gM、40gM和50gM的c-PG誘導(dǎo)SPCT。結(jié)論：隨著c-PG濃度的增加，血小板開始發(fā)生凝集和形成明顯的肉眼可見凝塊的時間快速縮短，本研究選擇c-PG終濃度為40μM應(yīng)用于SPCT。
　　 第二節(jié) c-PG與常用血小板激活劑誘導(dǎo)的

4、SPCT凝集強度和時間的比較
　　 目的：為SPCT選擇可視性好的血小板激活劑。
　　 結(jié)論： c-PG誘導(dǎo)PRP的凝塊最大，SPCT時間較短，結(jié)果更易于判定。
　　 第三節(jié) 血小板抑制劑對c-PG與常用血小板激活劑誘導(dǎo)的SPCT影響的比較
　　 目的：比較c-PG與常用血小板激活劑誘導(dǎo)的SPCT檢測血小板抑制劑的能力。結(jié)論：c-PG、瑞斯托霉素和AA均能檢測出PGI2、cAMP、EDTA和DMSO對血小

5、板的抑制作用。
　　 第四節(jié) c-PG、ADP和花生四烯酸誘導(dǎo)的SPOT檢測志愿者服用阿司匹林前后血小板功能變化
　　 目的：比較c-PG、ADP和AA誘導(dǎo)的SPCT檢測健康志愿者服用阿司匹林前后血小板功能變化的能力。結(jié)論：以40μM c-PG或500μg/mlAA為誘導(dǎo)劑的SPCT，均可高效檢測出服用阿司匹林后患者血小板功能的顯著變化。
　　 第五節(jié) 肝素和枸櫞酸鹽對c-PG誘導(dǎo)的SPOT的影響
　　

6、目的：檢測肝素和枸櫞酸鹽對c-PG誘導(dǎo)的SPCT的影響。結(jié)論：添加肝素和明顯增加枸櫞酸鹽濃度對c-PG誘導(dǎo)的SPCT無明顯影響。
　　 第六節(jié) c-PG溶液4℃冰箱儲存3年的穩(wěn)定性研究
　　 目的：檢測c-PG溶液儲存3年的穩(wěn)定性。結(jié)論：4℃儲存三年對c-PG溶液誘導(dǎo)的血小板凝集時間無明顯影響，c-PG具有良好的長期穩(wěn)定性。
　　 第七節(jié) 血小板計數(shù)和溫度對cPG誘導(dǎo)的SPCT影響
　　 目的：研究血小板

7、計數(shù)和溫度對cPG誘導(dǎo)的SPCT影響。結(jié)論：（1）血小板計數(shù)與SPCT有明顯的線性負(fù)相關(guān)。（2）20℃～40℃對SPCT無明顯影響；而溫度≤10℃時SPCT明顯延長。（3）室溫放置4小時對SPCT無明顯影響。
　　 第二部分 c-PG誘導(dǎo)的SPCT在捐血人群、患者和血小板制劑中的應(yīng)用
　　 本研究測定全血捐獻(xiàn)者和單采血小板捐獻(xiàn)者、服用抗血小板藥物的心內(nèi)科患者、化療致血小板減少癥患者、單采血小板、濃縮血小板和深低溫保存血小

8、板的SPCT，探索其SPCT的主要特征。并模擬血小板輸注的體外模擬混合SPCT，探索血小板輸注無效的輸血前篩查新方法。
　　 第一節(jié).全血捐獻(xiàn)者和單采血小板捐獻(xiàn)者的SPCT
　　 目的：測定全血捐獻(xiàn)者和單采血小板捐獻(xiàn)者SPCT。方法：隨機(jī)選取267名全血捐獻(xiàn)者和相對固定的單采血小板的捐血者84人次，分離PRP測定SPCT。結(jié)果：267份全血捐獻(xiàn)者和84份血小板捐獻(xiàn)者SPCT分別為73s±21s（最大值216s，最小值為4

9、1s）和72s±22s（最大值234s，最小值為38s），兩組無顯著差異（p>0.05）；8例SPCT大于180秒，占2.5％。結(jié)論：351份全血或血小板捐獻(xiàn)者SPCT平均值為73s，最大值234s，最小值為38s，血小板功能不良率為2.5％。
　　 第二節(jié) 服用抗血小板藥物的心內(nèi)科患者
　　 目的：測定服用抗血小板藥物治療的心內(nèi)科患者SPCT。方法：選取患有不穩(wěn)定性心絞痛和冠心病的服用抗血小板藥物的心內(nèi)科住院患者65例

10、，測定SPCT。結(jié)果：65例患者化療后患者的SPCT均大于300秒。結(jié)論：40μM的c-PG不能誘導(dǎo)服用抗血小板藥物連續(xù)超過3天患者的血小板在玻片上出現(xiàn)肉眼可見的凝集。
　　 第三節(jié) 化療后血小板嚴(yán)重減少患者
　　 目的：測定化療后血小板嚴(yán)重減少患者SPCT。方法：選取血液科預(yù)約輸注血小板治療的化療后血小板嚴(yán)重減少癥患者34例，測定SPCT。結(jié)果：出現(xiàn)凝集標(biāo)本5例（其中小于180秒者3例），其余29例（85.3％）在超過

11、300秒的計時內(nèi)均未凝集。結(jié)論：當(dāng)臨床醫(yī)生為化療患者申請血小板輸注治療時，患者外周血血小板計數(shù)往往已經(jīng)極度降低（多數(shù)患者<20×109/L），這時患者多數(shù)不適合采用SPCT檢測其血小板功能。
　　 第四節(jié) 22℃液態(tài)振蕩保存單采血小板和濃縮血小板的SPCT
　　 目的：測定單采血小板和濃縮血小板的SPCT。方法：1）隨機(jī)選取單采血小板90份，測定濃度為200×109/L、100×109/L、50×109/L、25×109

12、/L、12.5×109/L時的SPCT；2）隨機(jī)選取10份濃縮血小板，測定濃度為100×109/L、50×109/L、25×109/L、12.5×109/L時的SPCT。結(jié)果：1）單采血小板濃度為200×109/L、100×109/L、50×109/L、25×109/L、12.5×109/L時的SPCT分別為32s±7s、53s±14s、96s±29s、185s±50s；100例單采血小板中1例在計數(shù)為50×109/L時即不凝集，占1.

13、0％；血小板計數(shù)為25×109/L時，SPCT為184s±49s，（中位數(shù)180s，最小值102s，最大值298s），其中大于180s者49例（49.5％）；血小板計數(shù)為12.5×109/L時，凝集時間大于180s者16例（16.2％），不凝集81例（81.8％）。2）10袋手工分濃縮血小板當(dāng)計數(shù)為50×109L時，SPCT為95s±31s（中位數(shù)99.5s，最小值50s，最大值142s）：計數(shù)為25×109/L時，SPCT為179s±

14、58s（中位數(shù)169.5s，最小值118s，最大值281s），其中大于180s者4例（40％）；血小板計數(shù)為12.5×109/L時凝集時間大于180s 10例（100％），其中有5例不凝集（50％）。結(jié)論：血小板計數(shù)為50×109/L時，不出現(xiàn)凝集的單采血小板占1％，PC均出現(xiàn)凝集：血小板計數(shù)為25×109/L時，單采血小板SPCT大于180秒的占49.5％，PC為40％；血小板計數(shù)為12.5×109/L時，單采血小板SPCT大于180

15、秒的占98％，PC為100％。
　　 第五節(jié) 冰凍富含血小板血漿
　　 目的：測定冰凍PRP的SPCT。方法：隨機(jī)選取40份健康捐血者的PRP，測定FPRP、DMSO-PRP和Cryo-PRP的SPCT。結(jié)果：FPRP、DMSO-PRP和Cryo-PRP的SPCT分別為59s±14s、108s±17s、115s±19s。與FPRP比較，DMSO-PRP和Cryo-PRP SPCT均發(fā)生了顯著變化（p<0.001）；DMS

16、O-PRP和Cryo-PRP比較SPCT也發(fā)生明顯變化（p<0.005）。結(jié)論：由于含有5％DMSO并經(jīng)過冰凍降溫和復(fù)溫過程，冰凍PRP的SPCT較FPRP比較顯著的延長。
　　 第六節(jié) 血小板輸注有效性體外模擬混合SPCT實驗
　　 目的：體外模擬血小板輸注的混合SPCT實驗。方法：隨機(jī)選取申請血小板輸注的血小板極度減少的血液科患者18例，分離患者PRP按照患者總血容量與所輸機(jī)采血小板體積比混合，測定混合后的SPCT。