醫(yī)院環(huán)境微生物氣溶膠含量與傳播及其指示菌耐藥性的分子鑒定.pdf

1、微生物是醫(yī)院獲得性感染的主要因素，醫(yī)院環(huán)境的生物污染可以引起一系列傳染病的爆發(fā)流行。近幾年的研究表明，一些氣載病原微生物能夠通過空氣傳播造成傳染病的流行。過去對醫(yī)院環(huán)境微生物氣溶膠的傳播主要是通過培養(yǎng)皿的自然沉降法檢測細(xì)菌濃度的變化以及細(xì)菌耐藥性及某些致病菌含量等方面來確認(rèn)的。然而，未能證明醫(yī)院病房環(huán)境、門診房間內(nèi)外環(huán)境分離的微生物氣溶膠的起源及其同源性，未能用國際上通用的ANDERSEN-6采樣器等來測定氣溶膠微生物的含量等。因此，本

2、課題測量了ICU病房、門診注射室空氣環(huán)境(5個醫(yī)院的ICU病房環(huán)境及樓道、門診注射室3個房間及走廊和大廳)的氣載需氧菌的含量，在此基礎(chǔ)上，(1)統(tǒng)計ICU病房環(huán)境、門診注射室環(huán)境氣載大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的含量；(2)對從ICU病房環(huán)境分離的87株氣載大腸桿菌的耐藥性及其ESBLs耐藥基因的進(jìn)行了檢測：(3)采用分子生物學(xué)方法(ERIC-PCR)對ICU病房和門診注射室空氣環(huán)境中不同地點分離到的共131株大腸桿菌(其中病房87株、門診

3、44株)的遺傳相似性進(jìn)行聚類圖的比較；(4)采用血清學(xué)分型方法，進(jìn)一步對從門診注射室環(huán)境、ICU病房環(huán)境及周圍空氣環(huán)境中分離的131株大腸桿菌同時進(jìn)行了4組致病性因子的鑒定；(5)結(jié)合RFLP、PFGE、流式細(xì)胞儀技術(shù)(flow cytometer，F(xiàn)CM)對大腸桿菌的耐藥性、耐藥異質(zhì)性進(jìn)行了檢測。通過膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和PI(propidium iodide)的雙染色，做了細(xì)菌凋亡(apoptosis)的研究探討。根據(jù)以

4、上研究結(jié)果，評估了醫(yī)院環(huán)境微生物氣溶膠的危害性及其向環(huán)境中的傳播。 1、ICU病房、門診注射室環(huán)境氣載需氧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的含量 本試驗采用ANDERSEN-6級空氣微生物樣品收集器和RCS離心式采樣器在5個醫(yī)院的ICU病房環(huán)境及距病房環(huán)境5m、10m的走廊和大廳，一個醫(yī)院門診注射室環(huán)境的3個房間及其公共走廊和大廳的不同距離收集氣溶膠微生物，一方面，通過對醫(yī)院環(huán)境中氣載需氧菌含量、氣載大腸桿菌含量、氣載金黃色

5、葡萄球菌含量的檢測，以及它們在ANDERSEN六級采樣器上的分布規(guī)律來推斷其對病人及醫(yī)務(wù)工作人員自身可能造成的危害，從而使人們對醫(yī)院空氣環(huán)境中產(chǎn)生的微生物氣溶膠及其健康威脅的高度重視。研究結(jié)果表明，5個病房環(huán)境內(nèi)總的需氧菌含量和可吸入的需氧菌含量平均分別為126.8和70.38 CFU/m3空氣?？晌氲男柩蹙c需氧菌總的含量之比在47.9～70.2％之間，并且在5個病房環(huán)境內(nèi)所檢測的結(jié)果并沒有很大差異(p>0.05)。5個ICU病房環(huán)

6、境內(nèi)總的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌含量分別為63和96 CFU/m3空氣；可吸入的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌含量分別為43和81 CFU/m3。而且，每一個ICU病房環(huán)境內(nèi)氣載大腸桿菌和氣載金黃色葡萄球菌的含量差異極顯著(p<0.01)。在5個病房環(huán)境內(nèi)可吸入的金黃色葡萄球菌含量占總的金黃色葡萄球菌含量的比例在59.8～79.2％之間，而且它們之間并沒有顯著差異(p>0.05)。門診注射室環(huán)境氣載需氧菌和大腸桿菌在五個采樣點(Room A、

7、B、C、Comdor、Hill)的濃度分別是211和18 CFU/m3；206和18CFU/m3：304和13 CFU/m3；567和22 CFU/m3；651和18 CFU/m3。走廊和大廳中需氧菌和可吸入的需氧菌濃度明顯高于房間內(nèi)的(p<0.05)。氣載需氧菌中主要以葡萄球菌屬和埃希氏菌屬為主，其中革蘭氏陰性菌占需氧菌總數(shù)40.08％～46.98％。 2、ERIC-PCR對醫(yī)院空氣環(huán)境中氣載大腸桿菌向室外環(huán)境傳播的鑒定

8、 本課題測定了5個ICU病房和1個注射室及其公共走廊和大廳不同距離的空氣環(huán)境中大腸桿菌含量，在細(xì)菌學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，采用ERIC-PCR方法對不同地點分離到的大腸桿菌鑒定其同源性，獲得大腸桿菌ERIC片段指紋圖譜，通過該片段在細(xì)菌基因組內(nèi)的數(shù)量和分布之間的關(guān)系，比較其遺傳相似性，確定醫(yī)院環(huán)境內(nèi)微生物氣溶膠向環(huán)境中的傳播。ERIC-PCR結(jié)果表明，從ICU病房環(huán)境中分離到的大腸桿菌與距病房環(huán)境不同距離樓道內(nèi)(5m和10m)分離到的40株大

9、腸桿菌相似性可達(dá)100％，22株大腸桿菌的相似性在90％以上；從注射室環(huán)境三個房間、公共走廊和大廳內(nèi)分離到的大腸桿菌10株相似性可達(dá)100％，18株大腸桿菌相似性在90％以上。由此，可得出結(jié)論，ICU病房環(huán)境內(nèi)和樓道內(nèi)的分離到的大腸桿菌極有可能來源于病房環(huán)境內(nèi)的同一菌株，注射室環(huán)境內(nèi)，公共走廊和大廳內(nèi)分離到的大腸桿菌也可能來源于同株大腸桿菌。說明源于醫(yī)院環(huán)境內(nèi)微生物氣溶膠能夠通過氣體交換和人員的流動向周圍環(huán)境傳播，通過氣象條件和人員流動

10、傳播到不同的距離，造成周圍環(huán)境的空氣污染，引起醫(yī)院環(huán)境的獲得性交叉感染。 3、醫(yī)院空氣環(huán)境中大腸桿菌的血清學(xué)分型 采用血清學(xué)分型的方法進(jìn)一步對從門診注射室和ICU病房及周圍空氣環(huán)境中分離的共131株大腸桿菌同時進(jìn)行了4組致病性因子的血清學(xué)鑒定，一方面，可以驗證各種引起嬰幼兒腹瀉的致病性大腸桿菌，是否通過醫(yī)院環(huán)境中空氣的傳播，造成醫(yī)院環(huán)境交叉感染；另一方面，為研究分離的131株大腸桿菌是否存在O111、O55、O26、O1

11、19、O127、O157：H7和O128等血清群已被確認(rèn)為引起世界上許多國家嬰兒腹瀉爆發(fā)的致病因子。研究結(jié)果表明，通過血清學(xué)凝集試驗，EPEC陽性的有27株，共有7種血清型，其中優(yōu)勢血清型O142:K86(B)12株、3株O26:60(B6)、3株O127a:K63(B8)、3株O44:K74(L)、3株O114:K90(B)、2株O125:K70(B15)、1株0111:K58(B4)；ETEC陽性有10株，有3種血清型，其中6株O2

12、5：K19(L)、2株O8:K40(A)K47、2株O78:K80；EIEC凝集的有9株，共有2種血清型，其中O112ac:K66有5株、4株O124:K72；未檢到O157:H7。 4、醫(yī)院ICU病房環(huán)境中大腸桿菌耐藥性的檢測及其超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的鑒定 通過對醫(yī)院ICU病房環(huán)境及樓道空氣中分離的87株大腸桿菌耐藥性的調(diào)查、分析，進(jìn)一步證明了醫(yī)院環(huán)境中的大腸桿菌可以通過室內(nèi)外氣體的交換而相互傳播，可能對周圍環(huán)境

13、及其周邊病人、醫(yī)務(wù)工作人員的健康構(gòu)成潛在的威脅。同時還對87株醫(yī)源性大腸桿菌的產(chǎn)超廣譜p.內(nèi)酰胺酶(Extended Spectyumβ-Lactamase，ESBLs)耐藥基因(TEM、SHV、CTX-M)做了篩查。結(jié)果表明，大腸桿菌對青霉素類藥物、加酶抑制劑的抗生素和碳青烯酶類抗生素、對第一、二、三、四代頭孢類抗生素、單環(huán)類抗生素、氨基糖甙類抗生素、喹諾酮類藥物有不同程度的耐藥性。其中對青霉素類藥物耐藥率最高，對加酶抑制劑的抗生素和

14、碳青烯酶類抗生素的敏感率最高。通過與ERIC-PCR的同源性比較，其同源性在100％的菌株其耐藥菌譜也相同，進(jìn)一步證明了醫(yī)院環(huán)境中的氣載大腸桿菌可通過空氣傳播，造成醫(yī)源性的交叉感染。87株大腸桿菌的ESBLs耐藥基因譜以TEM基因為主。 藥敏試驗結(jié)果還顯示，大腸桿菌耐藥率高，多重耐藥菌株多，耐藥菌譜寬，且與我們在取樣時了解到的醫(yī)院環(huán)境的日常藥物使用情況相吻合，說明耐藥性的產(chǎn)生可能是由于治療過程中用藥情況復(fù)雜，種類繁多，而且用藥不

15、合理，以及與大腸桿菌的耐藥機(jī)制有關(guān)。 5、流式細(xì)胞儀檢測大腸桿菌的耐藥性及細(xì)菌的凋亡 采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對分離的E.coli和25922標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行了氨芐西林和頭孢噻肟的藥物敏感試驗；還通過PI(propidium iodide)和Annexin V雙熒光染色技術(shù)，對E. coli的細(xì)菌凋亡進(jìn)行了試驗分析；另外結(jié)合RFLP、PFGE、流式細(xì)胞儀技術(shù)(flow cytometer，F(xiàn)CM)對Ecoli進(jìn)行了的檢測。研究結(jié)果

16、表明，與抗生素共孵育后，PI染色E.coli的DNA，可以很準(zhǔn)確的計算出其MIC值，從而可確認(rèn)E.coli的藥物敏感結(jié)果；與抗生素共孵育后可以在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰(sub-G1峰，即AP峰，Apoptotic peak)，峰的面積代表凋亡細(xì)胞中的DNA含量。根據(jù)此亞二倍體峰面積，可以計算出凋亡細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中的所占的百分比。利用PI和Annexin V的雙染色，使用流式細(xì)胞儀檢測能夠可以區(qū)分正