屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測(cè)及SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物多重PCR分析.pdf

1、屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測(cè)是屏障環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容，病原微生物氣溶膠可直接影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量。目前，國(guó)內(nèi)動(dòng)態(tài)屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測(cè)的研究報(bào)道較少，也缺乏動(dòng)態(tài)屏障系統(tǒng)運(yùn)行情況的評(píng)價(jià)指標(biāo)和方法，不利于開(kāi)展污染源監(jiān)控;屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物的檢測(cè)主要是采用傳統(tǒng)的生理生化檢驗(yàn)法，檢測(cè)步驟多、周期長(zhǎng)，難以適應(yīng)對(duì)屏障內(nèi)大量動(dòng)物感染源的篩查要求。本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)屏障微生物氣溶膠的變化規(guī)律及屏障系統(tǒng)有害微生物來(lái)源，以期為進(jìn)一步建立屏障系統(tǒng)微生物氣溶

2、膠監(jiān)控體系提供實(shí)驗(yàn)參考;通過(guò)對(duì)多重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，以期建立屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物多重PCR快速分子檢測(cè)技術(shù)。主要包括2項(xiàng)試驗(yàn)內(nèi)容。
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)微生物氣溶膠監(jiān)測(cè)
　　 本試驗(yàn)以大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施為研究對(duì)象，分析屏障設(shè)施微生物氣溶膠的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其相關(guān)影響因素。測(cè)定并分析屏障設(shè)施各功能區(qū)域不同時(shí)間及不同工作狀態(tài)下空氣落下菌和直徑≥0.3um氣溶膠粒子的數(shù)量變化。結(jié)果表明，屏障系統(tǒng)內(nèi)空氣落下菌與氣溶

3、膠粒子在飼養(yǎng)工作后顯著升高，噴霧消毒后明顯降低;大、小鼠飼育室空氣落下菌與氣溶膠粒子數(shù)在凌晨時(shí)明顯升高，而兔飼育室在凌晨時(shí)間段則較低;清潔走廊和污物走廊在工作狀態(tài)時(shí)細(xì)菌含量明顯上升，非工作狀態(tài)時(shí)細(xì)菌含量一直處于較低的水平。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)的環(huán)境微生物與氣溶膠粒子的動(dòng)態(tài)數(shù)量變化與動(dòng)物品種、空氣消毒、人員進(jìn)出及動(dòng)物室內(nèi)的飼養(yǎng)操作等有關(guān)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖屏障系統(tǒng)是生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的主要場(chǎng)所，在屏障系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中，人員、物品、動(dòng)物都在不停地出入屏障。物

4、品經(jīng)過(guò)高壓消毒或高濃度過(guò)氧乙酸噴霧或浸泡進(jìn)入，空氣經(jīng)過(guò)四級(jí)過(guò)濾進(jìn)入，動(dòng)物是由隔離器內(nèi)傳出的SPF級(jí)動(dòng)物，人員經(jīng)過(guò)沐浴后換無(wú)菌服進(jìn)入，但是屏障系統(tǒng)運(yùn)行之后即很難完全達(dá)到SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)屏障系統(tǒng)內(nèi)人流、物流、動(dòng)物流進(jìn)行微生物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)人員清潔后仍可從口鼻腔分離到肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌，人員流動(dòng)可能是造成屏障內(nèi)污染的主要因素。
　　 2.SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易感微生物多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立
　　 本試驗(yàn)旨在建立SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)

5、動(dòng)物易感菌類(lèi)（主要包括金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌）的多重PCR快速檢測(cè)方法。根據(jù)各細(xì)菌特有的毒力基因即金黃色葡萄球菌nuc、肺炎克雷伯菌Phoe、銅綠假單胞菌opr(1)和肺炎鏈球菌PspA設(shè)計(jì)多組特異的引物，通過(guò)單一PCR、雙重PCR、多重PCR反應(yīng)篩選，并對(duì)每對(duì)引物和隨機(jī)混合引物進(jìn)行單基因組和多基因組特異性分析，得到特異的引物組合。通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度Tm值、鎂離子濃度、Taq酶濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定4對(duì)引物合