鹽對慢性腎衰大鼠腎臟磷酸化蛋白質(zhì)組及孤束核RAS的影響.pdf

1、第一部分不同濃度飲食鹽下慢性腎衰大鼠腎臟皮質(zhì)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 研究背景：
　　 據(jù)報道慢性腎衰早期高血壓的發(fā)生率為50％，發(fā)展到終末期有高血壓者為60～100％，而持續(xù)存在的高血壓又會加速慢性腎臟病的進展，形成惡性循環(huán)，因此積極控制血壓在慢性腎衰的各階段治療中都具有重要意義。飲食鹽的增加是促進高血壓發(fā)生發(fā)展的最重要的環(huán)境因素，并且飲食鹽的增加還具有獨立于血壓的作用，如導(dǎo)致左心室肥厚、動脈硬化、阻力血管狹窄、腎

2、臟肥大和腎間質(zhì)纖維化等。早在1976年Ylitalo研究小組就發(fā)現(xiàn)了在慢性腎衰的大鼠中存在鹽敏感性。此后Koomans等人發(fā)現(xiàn)慢性腎衰的患者也存在鹽敏感性。雖然關(guān)于慢性腎衰鹽敏感性的研究很多，但在慢性腎衰中飲食鹽是如何升高血壓的機制并不完全清楚，主要包括:鈉代謝異常，交感神經(jīng)活性增強，內(nèi)皮功能受損(NOS)、壓力感受器受損等，上述的一系列機制大多與蛋白磷酸化信號途徑的紊亂有關(guān)。雖然關(guān)于這方面的研究很多，但一般都局限于在特定生理或病理狀態(tài)

3、某一蛋白、某一通路的研究，沒能在整體蛋白質(zhì)水平上研究，不能形成一個統(tǒng)一的信號網(wǎng)絡(luò)來研究慢性腎衰鹽敏感性的機制。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是在細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)水平上進行研究，從蛋白質(zhì)整體活動的角度來認(rèn)識生命活動規(guī)律的一門新學(xué)科，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾主要包括磷酸化、S-亞硝基化、乙酰甲基化和糖基化等，而蛋白質(zhì)磷酸化是

4、生物界最普遍，最重要，研究最多的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆的過程，幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、細(xì)胞骨架調(diào)控、神經(jīng)活動、肌肉收縮、新陳代謝及腫瘤發(fā)生等過程內(nèi)的所有生命活動。目前有許多人類疾病是由于某些異常的磷酸化修飾所引起，包括腫瘤、糖尿病、免疫性疾病、心血管疾病等。腎臟中含有很多種磷酸化蛋白質(zhì)，磷酸化修飾在調(diào)節(jié)腎臟正常生理功能中有著很重要的意義，但異常的磷酸化修飾會引起疾病，如WNK的異常

5、磷酸化會引起高血壓和破壞酸堿及電解質(zhì)的平衡。因而分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾在不同生理病理狀態(tài)下的相對變化，可以進一步發(fā)掘與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要生物標(biāo)記物，為揭示其分子機理奠定基礎(chǔ)。
　　 雖然蛋白質(zhì)組學(xué)越來越多的用來鑒定組織中新的目標(biāo)蛋白，來揭示其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機制，但很少有研究運用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究慢性腎衰大鼠鹽敏感性的機制。本研究的主要目的是運用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究在慢性腎衰大鼠中給予不同濃度的飲食鹽所引起的差異性表達的

6、磷酸化蛋白，從而闡明慢性腎衰發(fā)生、發(fā)展及鹽敏感性的機制。
　　 研究方法：
　　 一、動物模型的構(gòu)建與組織樣本的采集
　　 1、實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境
　　 雄性Sprague Dawley大鼠（購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）體重150-180g，在SPF級環(huán)境實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境（南方醫(yī)院實驗動物中心）飼養(yǎng)，自由進水和飲食。
　　 2、大鼠5/6腎切除慢性腎衰模型制備
　　 大鼠體重200g左右

7、行左側(cè)腎臟2/3切，一周后進行右側(cè)腎全切（完全保留雙側(cè)的腎上腺），假手術(shù)大鼠只進行腎包膜剝離。
　　 3、大鼠在手術(shù)后2、4、6、8、10周分別進行眼眶靜脈采血，檢測大鼠血肌酐、尿素氮水平。
　　 4、實驗分組，不同濃度飲食鹽刺激大鼠2周
　　 在二期手術(shù)完成后的第9周，將慢性腎衰大鼠隨機分組:
　　 (1) Sham+正常鹽飲食飼料組(0.4％NaCl)(n=6)
　　 (2) CRF+正常鹽飲

8、食飼料組(0.4％NaCl)(n=6)
　　 (3) CRF+高鹽飲食飼料組(4％NaCl)(n=6)
　　 分組后，測量尾動脈血壓(softron BP-98A，Japan)作為基線血壓。第十周開始給予不同濃度的飲食鹽刺激大鼠2周。
　　 5、大鼠血、尿和腎臟組織的留取及處理
　　 1)術(shù)后第12周，測定大鼠血壓后將大鼠放于代謝籠中，留取24小時尿。
　　 2)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3

9、％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺上。
　　 3)開腹，腹主動脈采血，采血后迅速打開胸腔，灌胃針從左心室穿刺入主動脈，同時剪開右心耳，4℃預(yù)冷的生理鹽水（含肝素20U/ml）200ml快速沖洗，可看到腎臟、肝臟、肺皮膚和肌肉等快速變蒼白，右心耳流出液體無色清亮。
　　 4)迅速分離腎臟，放入盛有4℃預(yù)冷的1×PBS(PH7.4)的培養(yǎng)皿中清洗。
　　 5)剔除腎臟的被膜和周邊脂肪，稱重，分離腎臟的皮質(zhì)，包于錫箔紙

10、中，液氮速凍，-80℃保存。
　　 6、血肌酐和血尿素氮檢測（采用臨床自動生化分析儀檢測）;24h尿蛋白定量:（采用考馬斯亮藍(lán)-G250法檢測）。
　　 二、運用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)對腎臟皮質(zhì)進行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 1、蛋白提取
　　 每組各取適量組織塊樣品，各組內(nèi)6樣品等量混合，液氮研磨，裂解后

11、取上清液采用BCA法蛋白質(zhì)定量。
　　 2、SDS-PAGE電泳
　　 每組取約20μg蛋白質(zhì)樣品，按照5∶1(v/v)比例加入5X上樣緩沖液進行12.5％SDS PAGE電泳。
　　 3、酶解和肽段定量
　　 每組取約300μg蛋白樣品，用UA buffer(8M Urea，150mM TrisHCl pH8.0)對蛋白烷基化后加入胰蛋白酶酶解，完成后OD280肽段定量。
　　 4、肽段標(biāo)記

12、r>　　 每組取等量肽段（約80ug），按照試劑盒:iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進行標(biāo)記，重復(fù)標(biāo)記1次。將標(biāo)記后的肽段溶液混合，取1/10體積的混合肽段脫鹽，然后進行質(zhì)譜分析。取剩余的9/10體積混合肽段真空凍干，凍干后用于二氧化鈦富集。
　　 5、二氧化鈦富集
　　 標(biāo)記后的混合肽段溶液真空凍干，加入1×DHB buffer復(fù)溶。溶液中加入TiO2bea

13、ds，振蕩40min，離心，移去上清液。將beads轉(zhuǎn)入具塞tip頭中，加入washingbuffer1洗滌三次，加入washing buffer2洗滌三次。加入Elution buffer洗脫，收集磷酸化肽段，真空濃縮，用20μL0.1％FA溶解，取10μL用于質(zhì)譜分析。
　　 6、質(zhì)譜分析
　　 1)毛細(xì)管高效液相色譜
　　 樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC1000進行分離。
　　 2

14、)質(zhì)譜鑒定
　　 樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進行質(zhì)譜分析。
　　 7、數(shù)據(jù)分析
　　 1)質(zhì)譜數(shù)據(jù)
　　 質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，用軟件Mascot2.2和ProteomeDiscoverer1.3(Thermo Scientific)進行查庫鑒定及定量分析。
　　 2)數(shù)據(jù)庫
　　 本次使用數(shù)據(jù)庫:ipi.RAT.v

15、3.87.fasta(發(fā)布日期2011-2-27，蛋白質(zhì)序列39925條)。
　　 3) Mascot搜索
　　 查庫使用Mascot軟件版本為Mascot2.2。查庫時將RAW文件通過ProteomeDiscoverer提交至Mascot服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，然后進行數(shù)據(jù)庫搜索。
　　 4)定量分析
　　 Proteome Discoverer1.3軟件根據(jù)肽段報告離子峰強度值進行定量分析。肽

16、段定量結(jié)果為參考樣品所在標(biāo)簽的信號強度值與其他標(biāo)簽的信號強度值的比值。蛋白質(zhì)定量結(jié)果為鑒定肽段定量結(jié)果的中位數(shù)。最終定量結(jié)果再以各標(biāo)簽比值中位數(shù)進行歸一化處理，以消除實驗中人為因素引入的上樣量誤差。
　　 5) Phospho RS Note
　　 質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Mascot軟件搜索后，再由Proteome Discoverer1.3軟件對磷酸化肽段進行分析(Phospho RS score，PhosphopRS seque

17、nce probability，PhosphoRSsite probabilities), Phospho RS score大于50分，Phospho RS site probabilities大于75％說明磷酸化修飾的可信度較高。
　　 三、統(tǒng)計方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗;方差齊的多樣本均數(shù)的比較

18、采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法;方差不齊的多個樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較采用Dunnett's T3法。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.腎衰大鼠模型的確立
　　 在二步法5/6腎切除術(shù)后的第10周，測量各組大鼠的體重、血壓并采血測定肌酐、尿素氮含量、24小時尿蛋白。在第10周時，各組大鼠的體重?zé)o明顯變化(p＜0.05)，而CRF組收縮壓、血肌酐和尿素氮

19、、24小時尿蛋白較Sham組均顯著升高(p＜0.05)。
　　 2.不同濃度飲食鹽對大鼠血壓、24h尿蛋白和尿鈉的影響在正常飲食鹽中，CRF大鼠的血壓和24h尿蛋白的明顯改變(p＜0.05)。在CRF大鼠中，與正常鹽相比，CRF高鹽組大鼠血壓、尿鈉和24h尿蛋白顯著升高(p＜0.05)。
　　 3.不同濃度飲食鹽對大鼠腎臟皮質(zhì)總蛋白的影響
　　 3.1總蛋白質(zhì)譜鑒定
　　 運用蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)對各

20、組腎臟皮質(zhì)進行鑒定，鑒定出蛋白2725種，其中定量的蛋白有2695種。鑒定蛋白的定量比值頻數(shù)分布顯示大部分蛋白質(zhì)Ratio比值(NC/NS，HC/NC)接近1，呈對稱分布，符合統(tǒng)計學(xué)規(guī)律。
　　 3.2差異蛋白比值頻數(shù)分布
　　 對有定量信息的蛋白質(zhì)進行比較，并計算其顯著性指數(shù)。在正常飲食鹽中，與Sham大鼠比較(NC/NS)，CRF大鼠有318種蛋白差異表達(p＜0.05)，其中有164種蛋白表達升高，154種蛋白表達

21、下降;在CRF大鼠中，與正常飲食鹽比較(HC/NC)，高鹽CRF大鼠有310種蛋白差異表達(p＜0.05)，其中157種蛋白表達升高，153種蛋白表達下降。
　　 4.不同濃度飲食鹽對大鼠腎臟皮質(zhì)磷酸化肽段的影響
　　 4.1磷酸化肽段鑒定
　　 運用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)對各組腎臟皮質(zhì)進行鑒定，鑒定出磷酸化的肽段1911種，有定量信息的磷酸化肽段1810種，對應(yīng)989種磷酸化蛋白。鑒定磷酸化肽段的定量比

22、值頻數(shù)分布顯示大部分磷酸化肽段Ratio比值(NC/NS，HC/NC)接近1，呈對稱分布，符合統(tǒng)計學(xué)規(guī)律。
　　 4.2磷酸化肽段位點的分布
　　 對1810種有定量信息的磷酸化肽段進行磷酸化位點的鑒定，鑒定出2565個磷酸化位點，一個位點發(fā)生磷酸化的肽段最多，其次是兩位點發(fā)生磷酸化的肽段(1P1151、2P583、3P59、≥4P17)。
　　 4.3總磷酸化肽段的GO分類
　　 利用在線的Panthe

23、r數(shù)據(jù)庫，對有定量信息的磷酸化肽相應(yīng)的磷酸化蛋白進行功能分類。在質(zhì)譜鑒定出的腎臟皮質(zhì)磷酸化蛋白中，蛋白結(jié)合分子和催化活性分子是最主要的功能蛋白。對有定量信息的磷酸化肽相應(yīng)的磷酸化蛋白進行生物學(xué)過程分類。腎臟皮質(zhì)磷酸化蛋白參與了代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，其中以代謝最多，其次是生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運過程。
　　 4.4飲食鹽對腎臟皮質(zhì)磷酸化肽段的影響
　　 對有定量信息的磷酸化肽段進行比較，并計算其顯著

24、性指數(shù)。在正常飲食鹽中，與Sham大鼠比較(NC/NS)，CRF大鼠有197種磷酸化肽段差異表達(p＜0.05)，其中有113種磷酸化肽段表達升高，84種磷酸化肽段表達下降;在CRF大鼠中，與正常飲食鹽比較(HC/NC)，高鹽CRF大鼠有169種磷酸化肽段差異表達(p＜0.05)，其中78種磷酸化肽段表達升高，91種磷酸化肽段表達下降。
　　 4.5差異磷酸化蛋白的GO分類
　　 利用在線的Panther數(shù)據(jù)庫，對差異磷

25、酸化肽相應(yīng)的磷酸化蛋白進行功能分類，忽略未分類的磷酸化蛋白，在正常飲食鹽中，慢性腎衰所引起的差異磷酸化肽對應(yīng)的磷酸化蛋白的主要功能是結(jié)合蛋白核酸和催化活性(NC/NS);在慢性腎衰大鼠中，高鹽引起的差異磷酸化肽對應(yīng)的磷酸化蛋白的主要功能也是結(jié)合蛋白核酸和催化活性(HC/NC)。根據(jù)生物學(xué)過程分類，在正常飲食鹽中，慢性腎衰所引起的差異磷酸化肽對應(yīng)的磷酸化蛋白蛋白參與了代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，其中以代謝最多，

26、其次是生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運過程(NC/NS);在慢性腎衰大鼠中，高鹽引起的差異磷酸化肽對應(yīng)的磷酸化蛋白也參與了代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，其中以代謝最多，其次是生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運過程(HC/NC)。這些反映了慢性腎衰發(fā)生發(fā)展及鹽敏感性形成是復(fù)雜廣泛的調(diào)節(jié)模式。
　　 4.6差異磷酸化蛋白信號通路分析
　　 通過DAVID6.7在線分析軟件，對NC/NS組149種差異磷酸化蛋白和HC/NC組127種差異磷

27、酸化蛋白所涉及到的KEGG信號通路進行了分析。結(jié)果顯示，NC/NS組31種差異磷酸化蛋白所涉及到多種物質(zhì)代謝、病灶粘連、縫隙連接、MAPK、ErbB、mTOR、VEGF、Notch、NOD-like receptor、Calcium等信號通路，其功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞通訊和凋亡、藥物代謝、醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收等過程。HC/NC組32種差異磷酸化蛋白所涉及到多種物質(zhì)代謝、病灶粘連、粘附連接、mTOR、VEGF、Insulin等信

28、號通路，其功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞通訊和凋亡、藥物代謝等過程。
　　 4.7差異磷酸化蛋白的相互作用分析
　　 利用String數(shù)據(jù)庫對NC/NS，HC/NC兩組差異磷酸化蛋白質(zhì)作了進一步分析，在NC/NS差異磷酸化蛋白質(zhì)中，36個差異磷酸化蛋白質(zhì)被網(wǎng)絡(luò)，這些磷酸化蛋白質(zhì)很可能是慢性腎衰發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號通路中的成員。信號通路網(wǎng)絡(luò)中連接最多的3個蛋白分別是Polr2a、Srrm1、Srrm2，說明這3個磷酸化蛋白為

29、慢性腎衰發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號通路網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點，它們可能是慢性腎衰發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號通路磷酸化的重要靶點。在HC/NC差異磷酸化蛋白質(zhì)中，24個差異磷酸化蛋白質(zhì)被網(wǎng)絡(luò)，這些磷酸化蛋白質(zhì)很可能是慢性腎衰鹽敏感性形成的相關(guān)信號通路中的成員。信號通路網(wǎng)絡(luò)中連接最多的8個蛋白分別是Lmna、Des、Tnni3、Mydpc3、Vcl、Myh6、Myh7、Myh11，說明這8個磷酸化蛋白為慢性腎衰鹽敏感性形成的相關(guān)信號通路網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點，它們可能是慢性腎

30、衰鹽敏感性形成的相關(guān)信號通路磷酸化的重要靶點。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功運用iTRAQ技術(shù)對大鼠腎臟皮質(zhì)進行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，構(gòu)建了慢性腎衰大鼠腎臟皮質(zhì)磷酸化蛋白質(zhì)譜;鑒定出1911種磷酸化肽段，有定量信息的1810種，對應(yīng)989種磷酸化蛋白;
　　 2.發(fā)現(xiàn)149種差異磷酸化蛋白可能與慢性腎衰發(fā)生發(fā)展有關(guān)及127種差異磷酸化蛋白可能與慢性腎衰鹽敏感性的形成有關(guān);
　　 3.基于鑒定的慢性腎衰發(fā)

31、生發(fā)展及鹽敏感性形成相關(guān)信號通路的磷酸化蛋白質(zhì)，建立慢性腎衰發(fā)生發(fā)展及鹽敏感性形成相關(guān)信號通路的磷酸化蛋白質(zhì)的信號網(wǎng)絡(luò)。
　　 第二部分鹽攝入對慢性腎衰大鼠腦內(nèi)孤束核腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響
　　 研究背景：
　　 慢性腎臟病的防治已成為世界各國所面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一，而慢性腎衰是慢性腎臟病進展至一定時期時出現(xiàn)的代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征。CRF患者大部分有不同程度的高血壓，其發(fā)生率為60％～100％，

32、持續(xù)存在的高血壓又會加速慢性腎臟病的進展，形成惡性循環(huán)，因此積極控制血壓在慢性腎衰的各階段治療中都具有重要意義。眾所周知飲食鹽的增加是促進高血壓發(fā)生發(fā)展的最重要的環(huán)境因素，早在早在1976年Ylitalo研究小組就發(fā)現(xiàn)了在慢性腎衰的大鼠中存在鹽敏感性，此后Koomans等人發(fā)現(xiàn)慢性腎衰的患者也存在鹽敏感性，但這種鹽敏感性的機制尚不完全清楚。腎素血管緊張素系統(tǒng)在慢性腎衰高血壓的形成與發(fā)展起著很重要的作用，除了循環(huán)的RAS參與了這樣過程，腦

33、部的RAS也同樣參與了高血壓的形成。旱在1995年Teruya等人就證實了鹽敏感性與腦血管緊張素有關(guān)，隨隨后Leenen研究小組在Dahl鹽敏感性大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)高鹽可作用于腦部的腎素血管緊張素系統(tǒng)，而且鹽攝入與交感神經(jīng)活性呈正相關(guān)。在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，高鹽飲食引起的交感神經(jīng)過度活動和血壓的惡化能夠被AT1受體阻斷劑氯沙坦阻止;在高鹽飲食的Dahl S大鼠，腦室內(nèi)注射氯沙坦阻止了交感神經(jīng)的過度活動，抑制血壓的升高?？梢娭袠械腞

34、AS與慢性腎衰鹽敏感性的形成密切相關(guān)，但具體機制尚不清楚。
　　 在腦內(nèi)存在所有RAS的組分，腦內(nèi)的RAS系統(tǒng)可通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性在血壓的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，尤其與心血管調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)的腦干區(qū)域(孤束核NTS、頭端腹外側(cè)核RVLM)。在這些區(qū)域中，孤束核是迷走神經(jīng)和舌咽神經(jīng)終端的起始部位，是調(diào)節(jié)壓力感受器反射和動脈血壓調(diào)定點設(shè)置的重要區(qū)域。有研究證實在孤束核內(nèi)微量注射ANGⅡ可以消弱壓力感受器的敏感性，引起高血壓。循環(huán)中升高的

35、ANGⅡ可以通過血腦屏障作用有NTS，降低壓力感受器的敏感性，且腦內(nèi)注射AT1受體阻斷劑可以完全去除這一作用。從而推斷NTS里的RAS在血壓的調(diào)控中起著作用的作用。
　　 本研究以慢性腎衰大鼠為模型，通過用不同濃度的鹽對慢性腎衰大鼠進行干預(yù)，觀察慢性腎衰大鼠腦部孤束核RAS變化，在高鹽飲食下給予腦內(nèi)注射氯沙坦，探索慢性腎衰大鼠鹽敏感性形成的機制。
　　 一、動物模型的構(gòu)建與組織樣本的采集
　　 1、大鼠5/6腎切

36、除慢性腎衰模型制備及其鹽刺激
　　 大鼠體重200g左右行左側(cè)腎臟2/3切，一周后進行右側(cè)腎全切（完全保留雙側(cè)的腎上腺），假手術(shù)大鼠只進行腎包膜剝離。大鼠在手術(shù)后2、4、6、8、10周分別進行眼眶靜脈采血，檢測大鼠血肌酐、尿素氮水平。在二期手術(shù)完成后的第9周，將假手術(shù)和一部分慢性腎衰大鼠隨機分組:
　　 2、高鹽慢性腎衰大鼠腦室注射沙坦鉀
　　 在二期手術(shù)完成后的第9周，將另一部分慢性腎衰大鼠隨機分組:
　

37、　 (1) CRF+高鹽飲食(n=15)
　　 (2) CRF+高鹽飲食+腦室內(nèi)注射人工腦脊液(I.C.V CSF，12μl/24h)(n=15)
　　 (3) CRF+高鹽飲食+腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀(I.C.V losarta，1mg/kg體重d，體積12μl/24h)(n=15)
　　 分組后，測量尾動脈血壓(softron BP-98A，Japan)作為基線血壓。
　　 腦室內(nèi)注射泵的植入:腦室內(nèi)注

38、射采用ALZET微滲透壓泵（型號:2002）配合ALZET Brain Infusion Kit2套裝。第十周開始給予高鹽飲食刺激大鼠2周
　　 3、大鼠血、尿和腦組織的留取及處理
　　 1)術(shù)后第12周，測定大鼠血壓后將大鼠放于代謝籠中，留取24小時尿。
　　 2)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺上。
　　 3)開腹，腹主動脈采血，采血后迅速打開胸腔，灌胃針從左心室穿

39、刺入主動脈，同時剪開右心耳，4℃預(yù)冷的生理鹽水（含肝素20U/ml）200ml快速沖洗，可看到腎臟、肝臟、肺皮膚和肌肉等快速變蒼白，右心耳流出液體無色清亮
　　 4)每組部分老鼠（5只）4℃預(yù)冷的生理鹽水快速灌注后，換為4℃的4％多聚甲醛液(PH7.2)400ml灌注1.5h，之后小心剪開顱骨取腦，在大鼠腦模具內(nèi)，分離孤束核，置4％的多聚甲醛液內(nèi)固定，用于做腦組織石蠟切片的免疫組化。
　　 5)每組剩余的老鼠（5只）4℃

40、預(yù)冷的生理鹽水快速灌注后，開顱骨取腦，在大鼠腦模具內(nèi)，分離孤束核，包于錫箔紙中，液氮速凍，-80℃保存。
　　 二、檢測血中的肌酐、尿素氮、血鈉、24h尿蛋白、尿鈉
　　 三、Real-time PCR檢測腦內(nèi)孤束核腎素—血管緊張素系統(tǒng)AGT、ACE、AT1RmRNA水平的表達
　　 取各組大鼠孤束核組織放于1.5ml EP管，按組織重量:TRIZOL=1∶10的比例進行反復(fù)吹打，提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄，qRT-

41、PCR檢測AGT、ACE、AT1 mRNA水平的表達。
　　 四、免疫組化檢測腦內(nèi)孤束核腎素—血管緊張素系統(tǒng)AGT、ACE、ANGⅡ、AT1R蛋白水平的表達
　　 五、Western Blotting檢測孤束核組織ACE、AT1R蛋白水平的表達。
　　 將儲存于-80℃內(nèi)的組織取出，稱重，按組織重量∶裂解液=1∶4的比例加入裂解液，用5ml注射器反復(fù)吹打組織，以上操作均在冰上進行，勻漿完全后，13000g，4℃離

42、心40min，去掉漂浮于上層的脂滴，提取中間層的勻漿液，即為孤束核組織的總蛋白，加入SDS(5×)上樣緩沖液，95℃煮沸蛋白，Western Blotting檢測孤束核組織ACE、AT1R蛋白水平的表達。
　　 六、統(tǒng)計方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。與常數(shù)項比較，采用單樣本t檢驗;兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗;方差齊的多樣本均數(shù)的

43、比較采用One-WayANOVA，兩兩比較采用LSD法;方差不齊的多個樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較采用Dunnett's T3法。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、腎衰大鼠模型的確立
　　 在二步法5/6腎切除術(shù)后的第10周，測量各組大鼠的體重、血壓并采血測定肌酐、尿素氮含量、24小時尿蛋白。在第10周時，各組大鼠的體重?zé)o明顯變化(p＜0.05)，而CRF組收縮壓、血肌酐和尿素

44、氮、24小時尿蛋白較Sham組均顯著升高(p＜0.05)。
　　 2.不同濃度飲食鹽對大鼠血壓的影響
　　 在Sham大鼠中，與正常鹽比較，給予低鹽或高鹽飲食14天均未能引起血壓的明顯改變(p＞0.05)。在CRF大鼠中，與正常鹽相比，給予低鹽飲食未引起血壓的顯著下降(p＞0.05)，而高鹽飲食引起血壓顯著升高(p＜0.05)。
　　 3.不同濃度飲食鹽對大鼠24h尿蛋白的影響
　　 在Sham大鼠中，與

45、正常鹽比較，給予低鹽或高鹽飲食14天均未能引起24h尿蛋白的明顯改變(p＞0.05))。在CRF大鼠中，與正常鹽相比，給予低鹽飲食未引起24h尿蛋白的顯著下降(p＞0.05)，而高鹽飲食引起24h尿蛋白顯著升高(p＜0.05)。
　　 4.不同濃度飲食鹽對大鼠體重、血鈉和尿鈉的影響
　　 無論在Sham還是CRF大鼠中，與正常鹽比較，給予低鹽或高鹽飲食14天對體重?zé)o顯著改變(p＞0.05)，但低鹽飲食減少尿鈉的排泄，高鹽

46、飲食增加尿鈉的排泄(p＜0.05);低鹽或高鹽飲食對Sham大鼠的血鈉無顯著改變(p＞0.05)，高鹽飲食升高CRF大鼠的血鈉(p＜0.05)。
　　 5.不同濃度飲食鹽對大鼠腦孤束核(NTS)部位RAS的影響
　　 5.1不同濃度飲食鹽下孤束核(NTS)部位RAS mRNA的表達
　　 在正常鹽飲食中，CRF大鼠腦部NTS部位AGT、ACEmRNA的表達與Sham大鼠相比顯著增強(p＜0.05);在低鹽飲食中，

47、CRF大鼠腦部NTS部位AGT、AT1mRNA的表達與Sham大鼠相比顯著增強(p＜0.05);在高鹽飲食中，CRF大鼠腦部NTS部位ACE、AT1 mRNA的表達與Sham大鼠相比顯著增強(p＜0.05);無論在Sham還是CRF大鼠中，與正常鹽相比，高鹽鹽飲食增加腦部NTS部位AGT、ACE、AT1mRNA的表達(p＜0.05)。
　　 5.2不同濃度飲食鹽下孤束核(NTS)部位RAS蛋白水平的表達
　　 無論在低鹽

48、、正常鹽或是高鹽飲食中，CRF大鼠腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達與Sham大鼠相比顯著增強(p＜0.05);在Sham大鼠中，與正常鹽相比，低鹽飲食抑制腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達(p＜0.05)，高鹽無明顯改變;在CRF大鼠中，與正常鹽相比，低鹽飲食抑制腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達(p＜0.05)，高鹽飲食增加腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達(p

49、＜0.05)。
　　 6.腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀對高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠血壓的影響
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，與高鹽CRF大鼠相比，給予腦室內(nèi)注射CSF對血壓無明顯影響，而腦室內(nèi)注射氯沙坦時血壓明顯下降(p＜0.05)。
　　 7.腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀對高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠24h尿蛋白的影響
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，與高鹽CRF大鼠相比，給予腦室內(nèi)注射CSF對24h尿蛋白無明顯影響，而腦室內(nèi)

50、注射氯沙坦時24h尿蛋白明顯下降(p＜0.05)。
　　 8.腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀對高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠腦孤束核(NTS)部位RAS的影響
　　 8.1腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀時高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠孤束核(NTS)部位RASmRNA的表達
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，給予腦室內(nèi)注射氯沙坦，觀察其對NTS部位RASmRNA的影響情況，結(jié)果顯示:與高鹽CRF大鼠相比，腦室內(nèi)注射氯沙坦抑制AGT、ACE、AT1R

51、mRNA的表達(p＜0.05)。
　　 8.2腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀時高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠孤束核(NTS)部位RAS蛋白水平的表達
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，與高鹽CRF大鼠相比，給予腦室內(nèi)注射CSF對NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1均無明顯影響(p＞0.05)，而腦室內(nèi)注射氯沙坦時NTS部位AT1表達明顯減少，反饋性引起AGT、ACE、ANGⅡ表達顯著升高(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：