芍藥花色形成相關miRNA的挖掘及功能分析研究.pdf

1、芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）是中國的傳統(tǒng)名花之一，自古以來就有“花相”的美譽。因其具有極高的觀賞價值而被廣泛應用于植物造景和庭院綠化中，目前在世界眾多國家廣為栽培?；ㄉ怯^賞植物最重要的性狀之一，其直接影響著植物的觀賞價值和商業(yè)品質。芍藥花色豐富，可以分為9大色系，但目前對于芍藥花色的研究主要集中于色素測定、結構基因的克隆與表達分析和轉錄組測序分析等方面，雖然初步明確了芍藥花色形成的代謝和轉錄調控機制，但對于

2、miRNA介導的轉錄后調控機制尚不清楚，而明晰芍藥花色形成相關的miRNA及調控機制對于全面闡明芍藥花色形成機理、培育珍稀花色新品種意義重大。為此，本研究以外瓣紅色、內瓣黃色的芍藥復色品種‘金輝’為材料，通過miRNA測序鑒定芍藥內、外瓣差異表達miRNA、篩選調控花瓣色澤形成的候選miRNA及其靶基因、明確關鍵miRNA調控色澤形成的轉錄后機制。主要結果如下:
　　(1)對影響花色形成的理化因子研究發(fā)現(xiàn)，色素分布、表皮形狀、細胞

3、液pH值、有機酸含量和礦質元素含量并不與芍藥內、外瓣色澤差異形成具有顯著相關性。隨后，構建了內、外瓣miRNA文庫并進行測序，在去除低質量的reads后，分別從內、外瓣6組樣品中獲得超過96.54％的高質量clean reads，拼接后共獲得1，756，525和2，045，228條miRNA，共有331個已知的miRNA和66個新預測的miRNA在6組樣品中表達含量不一致。通過差異分析共得到163個已知的差異表達miRNA和28個新預測

4、的差異表達miRNA;而在已知的差異表達miRNA中，80個miRNA表達下調，83個miRNA表達上調;在新預測的差異表達miRNA中，18個miRNA表達下調，10個miRNA表達上調，并對其靶基因進行了功能注釋為生化代謝途徑和信號轉導途徑。通過隨機對獲得的miRNA前體序列進行亞克隆和表達模式進行檢測均驗證了miRNA測序結果的準確可靠。
　　(2)通過比較3種小RNA提取方法，發(fā)現(xiàn)改良多步法提取芍藥花瓣小RNA效果較好，提

5、取的miRNA質量高，穩(wěn)定性好，能夠滿足芍藥miRNA方面的研究。通過將miRNA測序結果與轉錄組數(shù)據進行聯(lián)合分析，根據靶基因的功能共篩選出miR156e-3p、miR828a、miR156d、miR2616和Novel-miR25等5個調控芍藥花色形成的候選miRNA。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術對候選miRNA及其靶基因在不同發(fā)育時期花瓣中的表達模式進行檢測后發(fā)現(xiàn)，miR156e-3p及其靶基因Unigene1041

6、1表達趨勢呈顯著負相關性，在對miR156e-3p的靶基因Unigene10411序列進行克隆比對，其與其他物種SPL(squamosa promoter-binding-like protein)基因相似性達81％以上，命名為PlSPL1。
　　(3)構建了以miR156e-3p前體序列為目的基因的表達載體，利用液氮凍融法將載體導入農桿菌，采用擬南芥花序浸染法獲得轉基因植株，并采用培養(yǎng)基篩選、GUS染色、PCR擴增、qRT-PC