重組大鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子(rR-PDGF-AA)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠椎間盤細(xì)胞促增殖的影響作用.pdf

1、背景：自人類行醫(yī)學(xué)史記載，頸肩痛、腰腿痛就是其所涉及的內(nèi)容，而椎間盤退變又是頸腰痛最常見的原因。1934年，Mixter和Barr[1]首先通過(guò)手術(shù)證實(shí)和治愈腰椎間盤突出壓迫神經(jīng)根所致的坐骨神經(jīng)痛，從而開創(chuàng)了所謂的“椎間盤時(shí)代(Dynasty of the disc)”。髓核摘除這一經(jīng)典術(shù)式70余年來(lái)治愈了無(wú)數(shù)椎間盤病變的患者，然而這70余年來(lái)，全世界每年有數(shù)千篇相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)表，每次相關(guān)骨科會(huì)議，椎間盤病變?nèi)允亲钪饕淖h題之一。這一事實(shí)

2、也說(shuō)明，目前椎間盤退變性疾病的治療仍存在許多問(wèn)題，需要繼續(xù)深入地研究和探索。近幾年來(lái)，組織工程學(xué)的研究也擴(kuò)展到脊柱外科的領(lǐng)域，國(guó)外學(xué)者開展了組織工程椎間盤相關(guān)的基礎(chǔ)研究工作。雖然發(fā)表的研究報(bào)告數(shù)量尚少，然而卻反應(yīng)了本研究可喜的前景。 目的：研究與椎間盤變性或再生相關(guān)的環(huán)境因素以及椎間盤組織和細(xì)胞的生物學(xué)行為，觀察血小板衍生生長(zhǎng)因子對(duì)體外培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞分裂增殖及基質(zhì)合成的影響，從細(xì)胞水平、分子生物學(xué)及基因水平對(duì)變性椎間盤進(jìn)行基因治

3、療和組織工程學(xué)研究。 方法： 1、分離并消化大鼠椎間盤組織得到單個(gè)細(xì)胞并完成原代細(xì)胞接種培養(yǎng)。 2、在原代細(xì)胞融合傳代后建立對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(施加1μg/L，10μg/L，100μg/L，1000μg/L不同濃度血小板衍生生長(zhǎng)因子刺激生長(zhǎng))。 3、采用HE、甲苯胺藍(lán)染色法定時(shí)于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、增殖的變化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。 4、采用MTT(噻唑藍(lán)比色)法測(cè)定椎間盤細(xì)

4、胞的吸光度值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 5、將傳代細(xì)胞消化為單個(gè)，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定處于S期(DNA合成期)細(xì)胞含量。 6、經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析得出結(jié)論。 結(jié)果： 1、在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察，10天后95％以上的細(xì)胞貼壁，原代細(xì)胞多為梭形，有偽足伸出；經(jīng)胰酶消化傳代后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)速度加快，而加入血小板衍生生長(zhǎng)因子組椎間盤細(xì)胞匯合時(shí)間縮短，生長(zhǎng)加速。 2、HE染色細(xì)胞多為梭形，有偽足伸出，細(xì)胞核為圓形或橢圓

5、形，圍繞細(xì)胞核，胞漿內(nèi)可見較多空泡；甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞核為紫色，胞漿染為深藍(lán)色。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。 3、MTT法測(cè)定椎間盤細(xì)胞吸光度(OD)值經(jīng)過(guò)方差分析檢驗(yàn)可知，F(xiàn)值為20.276，P=0.000，說(shuō)明五組之間比較差異具有顯著性。五組之間兩兩比較得出，對(duì)照組、1μg/L組和10μg/L組之間比較無(wú)差異，1000μg/L組和100μg/L組之間比較無(wú)差異，對(duì)照組、1μg/L組、10μg/L組分別與1000μg/

6、L組、100μg/L組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.05)。 4、隨著生長(zhǎng)因子濃度的增加，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)處于S期的細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)。rR-PDGF-AA能提高細(xì)胞的增殖活性，并且在有效濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)為椎間盤細(xì)胞的培養(yǎng)提供了簡(jiǎn)單、有效的方法，血小板衍生生長(zhǎng)因子對(duì)體外培養(yǎng)的椎間盤細(xì)胞的分裂增殖、基質(zhì)中膠原及蛋白多糖的合成具有促進(jìn)作用，可明顯提高細(xì)胞線粒體活性、增加S期細(xì)胞百分比