化瘀通絡(luò)中藥對(duì)肝纖維化大鼠的治療作用及其對(duì)血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)及Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的:肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的一個(gè)動(dòng)態(tài)過程及共同病理途徑,是肝臟纖維結(jié)締組織過度沉積的結(jié)果。肝纖維化是機(jī)體對(duì)慢性損傷的主動(dòng)性修復(fù)反應(yīng),以肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular matrix,ECM),的增生與沉積為特征,形態(tài)上表現(xiàn)為肝竇毛細(xì)血管化與肝小葉內(nèi)纖維化,功能上可引起肝功能減退、門靜脈高壓等,甚至發(fā)展成為肝癌,嚴(yán)重影響患者的生命健康。因此,及時(shí)治療阻斷肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)

2、展意義重大。很多細(xì)胞因子參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet derivative growth factor,PDGF)是已知的最強(qiáng)的促肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖分化的細(xì)胞因子,它能夠強(qiáng)烈刺激HSC的增殖、遷移,轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,促使膠原產(chǎn)生、沉積,在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中意義重大。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究,但臨床上阻斷肝纖維化仍是一個(gè)難題,近年來

3、開展的中醫(yī)藥抗肝纖維化的臨床和基礎(chǔ)研究顯示了一定的優(yōu)勢(shì)和較大的潛力?；鐾ńj(luò)中藥鱉甲煎丸出自張仲景《金匾要略》,具有化瘀通絡(luò)、。軟堅(jiān)散結(jié)之功效,攻補(bǔ)兼施,作用全面。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),鱉甲煎丸應(yīng)對(duì)肝纖維化的復(fù)雜病機(jī)可通過多途徑、多靶點(diǎn)的發(fā)揮中醫(yī)藥抗肝纖維化的作用。本研究通過對(duì)SD大鼠采用皮下注射四氯化碳(CCL4)的方法建立肝纖維化大鼠模型,應(yīng)用化瘀通絡(luò)中成藥鱉甲煎丸對(duì)該模型進(jìn)行干預(yù),通過觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況,檢測(cè)血清層粘連蛋白(LN)、Ⅳ

4、型膠原(Col-Ⅳ),血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清白蛋白(ALB)的含量,觀察肝臟病理學(xué)形態(tài),檢測(cè)肝組織PDGF水平,肝組織Ras、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase,ERK1)水平,探討化瘀通絡(luò)中藥對(duì)肝纖維化的防治作用及其可能作用機(jī)制,為臨床上治療以“氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)”為基本病因病機(jī)的“癥積”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:

5、清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只,體重280-320g,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、西藥組(Thewestern medicine group,簡(jiǎn)稱XY)、化瘀通絡(luò)中藥低劑量組(Low dosetreated)簡(jiǎn)稱ZY(L)、中劑量組(Middle dose treated)簡(jiǎn)稱ZY(M)、高劑量組(High dose treated)簡(jiǎn)稱ZY(G)。除正常組外,模型組、中藥各組、西藥組

6、均于實(shí)驗(yàn)第1天每只大鼠皮下注射40％CCl4花生油5ml/kg,此后每3天注射3ml/kg,同時(shí)從實(shí)驗(yàn)第一天起,中藥各組分別給予化瘀通絡(luò)中藥低、中、高劑量組大鼠鱉甲煎丸0.55g/(kg.d)、1.1 g/(kg.d)、2.2g/(kg.d)灌胃,西藥組給予秋水仙堿0.3mg/kg灌胃,每日一次。從實(shí)驗(yàn)第四周末開始,每周末隨機(jī)處死模型組大鼠,光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變,實(shí)驗(yàn)第6周造模成功。造模成功后給予中藥各組大鼠及西藥組大鼠繼續(xù)灌胃5周

7、,每日一次。從實(shí)驗(yàn)第一天開始,模型組大鼠給予蒸餾水灌胃,共11周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,正常組大鼠皮下注射等量花生油,并給予蒸餾水灌胃,每日1次,共6周,6周停止皮下注射花生油,繼續(xù)給予蒸餾水灌胃5周。于實(shí)驗(yàn)第11周末,禁食12小時(shí),水合氯醛麻醉,股動(dòng)脈放血,分離血清,測(cè)定血清ALT、AST、ALP、ALB水平;放射免疫法檢測(cè)血清LN、Col-Ⅳ水平;摘取大鼠肝臟,留取肝組織,置于4%多聚甲醛固定液中,應(yīng)用旺染色及Masson染色觀察各組大鼠的肝

8、臟病理形態(tài)學(xué)變化;留取肝組織于液氮速凍后置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存,反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chainreaction RT-PCR)法檢測(cè)肝組織中PDGF含量、Ras蛋白水平;免疫組化方法檢測(cè)肝組織中ERK1的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1各組大鼠的一般情況
　　 在實(shí)驗(yàn)過程中,正常組除外,其余各組均有死亡情況:模型組死亡3只,中藥高劑量組死亡1只,

9、中藥低、中劑量組各死亡2只,西藥組死亡3只。正常組大鼠體重呈進(jìn)行性增長(zhǎng),飲食正常,反應(yīng)敏捷,眼光有神,毛發(fā)有光澤。其余各組大鼠一般狀況較差,反應(yīng)遲鈍,皮毛松弛,毛色暗淡,潮濕成縷,其中模型組個(gè)別大鼠出現(xiàn)雙目失明,且脾氣急躁易怒,易激惹,形體消瘦。
　　 2各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)改變
　　 正常組大鼠肝臟形態(tài)正常,包膜完整,色淡紅,切面光滑整齊。肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞多為單核,肝板呈條索狀,肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列。

10、模型組大鼠,肝臟形態(tài)異常,表面毛糙、質(zhì)脆,切面有沙粒感。大鼠肝細(xì)胞腫脹變大,肝細(xì)胞廣泛壞死,肝臟匯管區(qū)擴(kuò)大及炎細(xì)胞浸潤(rùn),肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生明顯,將肝小葉包繞成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán),形成假小葉?；鐾ńj(luò)中藥各劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰,肝竇輕度擴(kuò)張,肝細(xì)胞中度壞死,匯管區(qū)纖維結(jié)締組織中度增生,假小葉形成明顯較少。西藥組肝臟病理變化介于模型組與中藥組之間。提示,化瘀通絡(luò)中藥可改善肝纖維化大鼠的肝臟纖維化程度,且相對(duì)于西藥秋水仙

11、堿效果更明顯。
　　 3各組大鼠血清ALT、AST、ALP、ALB水平
　　 各組大鼠血清ALT、AST、ALP含量結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組、西藥組、中藥低、中劑量組大鼠血清ALT、AST、ALP含量明顯升高(P＜0.05),中藥高劑量組與正常組ALT、AST、ALP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比,中藥各劑量組、西藥組血清ALT、AST、ALP明顯降低(P＜0.05);與西藥組相比,中藥高劑量組血清ALT、AS

12、T、ALP含量明顯減低(P＜0.05),中藥低劑量組含量較高(P＜0.05),中藥中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥各劑量組之間相比,中藥低劑量組血清ALT、AST、ALP含量高,中藥高劑量組含量最低,中藥中劑量組居中,中藥各劑量組間存在顯著性差異(P＜0.05)。提示,化瘀通絡(luò)中藥可明顯降低肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP水平,有助于肝纖維化的治療。
　　 各組大鼠血清ALB含量的結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組、西藥組、

13、中藥低、中劑量組大鼠血清ALB含量明顯降低(P＜0.05),中藥高劑量組與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比,西藥組、中藥高、中劑量組血清ALB含量明顯升高(P＜0.05),中藥低劑量組與之差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西藥組相比,中藥高劑量組血清ALB含量明顯升高,中藥低劑量組血清ALB水平降低(P＜0.05),中藥中劑量組與之相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥各劑量組間血清ALB水平兩兩比較差異,其中,中藥高劑量組血清ALB含量最高,中藥中劑量組次

14、之,中藥低劑量組含量最低(P＜0.05)。提示,化瘀通絡(luò)中藥可使血清ALB水平下降趨勢(shì)得到扭轉(zhuǎn),有助于肝纖維化的治療。
　　 4各組大鼠血清LN、Col-Ⅳ水平
　　 各組大鼠血清LN、Col-Ⅳ含量結(jié)果示:與正常組相比,模型組、西藥組、中藥低、中劑量組大鼠血清LN、Col-Ⅳ含量明顯升高(P＜0.05),中藥高劑量組與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比,中藥各劑量組、西藥組血清LN、Col-Ⅳ明顯降低(P＜0.05)

15、;與西藥組相比,中藥高劑量組血清LN、Col-Ⅳ含量明顯減低(P＜0.05),中藥低劑量組含量較高(P＜0.05),中藥中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥各劑量組之間相比,中藥低劑量組血清LN、Col-Ⅳ含量高,中藥高劑量組含量最低,中藥中劑量組居中,中藥各劑量組間存在顯著性差異(P＜0.05)。此結(jié)果提示,化瘀通絡(luò)中藥可明顯降低肝纖維化大鼠血清LN、Col-Ⅳ含量,此可能為其治療肝纖維化的機(jī)制之一。
　　 5化瘀通絡(luò)中藥對(duì)肝纖

16、維化大鼠Ras/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響
　　 5.1各組大鼠肝臟組織PDGF mRNA含量、Ras蛋白mRNA水平
　　 各組大鼠肝組織PDGF mRNA、Ras mRNA含量的表達(dá)結(jié)果顯示:與正常組相比,其余各組PDGF mRNA、Ras mRNA含量均升高(P＜0.05),其中模型組含量最高,中藥低劑量組次之,西藥組、中藥中劑量組再次之,中藥高劑量組含量表達(dá)最低(P＜0.05);與模型組相比,余各組肝組織PDGFm

17、RNA、Ras mRNA含量的表達(dá)均較低(P＜0.05);與西藥組相比,中藥中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中藥各劑量組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其中,中藥低劑量組表達(dá)較高,中藥中劑量組次之,中藥高劑量組肝組織PDGF mRNA、Ras mRNA含量的表達(dá)最低。
　　 5.2各組大鼠肝組織ERK1含量表達(dá)
　　 正常組大鼠肝組織中ERK1呈棕黃色弱陽性表達(dá),主要可見于小葉中央靜脈四周、匯管區(qū)及肝索Disse腔間

18、隙中,高倍鏡下觀察可見ERK1位于Disse間隙的肝星狀細(xì)胞胞質(zhì)中,肝細(xì)胞中未見表達(dá);模型組大鼠肝組織中ERK1表達(dá)明顯增多、增強(qiáng),匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝小葉內(nèi)均可見大量星芒狀、條索狀ERK1陽性表達(dá),高倍鏡下觀察可見肝星狀細(xì)胞胞質(zhì)、胞核為ERK1陽性表達(dá)的分布區(qū)域;其余西藥組、中藥各劑量組陽性染色程度較模型組明顯減輕,纖維隔內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞及炎細(xì)胞陽性染色程度減輕,ERK1陽性細(xì)胞數(shù)目減少,其中中藥高劑量組ERK1陽性程度最低,西藥組

19、、中藥中劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),中藥低劑量組ERK1陽性程度較中藥高、中劑量組稍高,但較模型組較低(P＜0.05)。
　　 提示,化瘀通絡(luò)中藥可明顯降低肝組織中PDGF mRNA的含量并減少Ras蛋白mRNA的表達(dá),明顯減少大鼠肝組織ERK1的表達(dá),顯著改善大鼠抗肝纖維化能力,此可能為其治療肝纖維化的機(jī)制之一。
　　 結(jié)論:
　　 1化瘀通絡(luò)中藥可改善肝纖維化大鼠的一般狀況,改善肝功能。

20、>　　 2化瘀通絡(luò)中藥可明顯改善肝纖維化大鼠肝臟纖維化程度,對(duì)于肝纖維化有良好的治療作用。
　　 3化瘀通絡(luò)中藥可明顯降低肝纖維化大鼠血清LN、Col-Ⅳ水平,減少二者在肝Disse間隙沉積,從而減少ECM蓄積,此可能為其治療肝纖維化的機(jī)制之一。
　　 4化瘀通絡(luò)中藥可明顯下調(diào)肝纖維化大鼠肝臟組織中PDGF mRNA、Ras蛋白mRNA以及ERK1的表達(dá),提示其抗肝纖維化作用可能是通過激活Ras/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通