IGF-Ⅰ和PDGF-AA對(duì)體外培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞的促增殖作用及兩者的比較.pdf

1、背景：自古以來(lái)腰腿痛就困擾著人們的生活，卻遲遲找不到真正原因。直到1934年，Mixter和Barr提出“椎間盤時(shí)代(Dynasty of the disc)”，人們才開始慢慢認(rèn)識(shí)這一病變，對(duì)其的發(fā)生發(fā)展才開始進(jìn)行進(jìn)一步的研究。近幾年來(lái)，隨著組織工程學(xué)的研究也擴(kuò)展到脊柱外科的領(lǐng)域，國(guó)外學(xué)者開展了組織工程椎間盤相關(guān)的基礎(chǔ)研究工作。雖然發(fā)表的研究報(bào)告數(shù)量尚少，然而卻反應(yīng)了本研究可喜的前景，不過(guò)關(guān)于體外培養(yǎng)的椎間盤細(xì)胞的研究及認(rèn)識(shí)卻相對(duì)較少。

2、但由于細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)具有較好的重復(fù)性、費(fèi)用低、結(jié)果分析較簡(jiǎn)單，無(wú)倫理問(wèn)題等特點(diǎn)，使其在椎間盤退變研究中引起重視并不斷得到應(yīng)用。
　　 目的：隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已開始涉及椎間盤退行性變這一領(lǐng)域。胰島素樣生長(zhǎng)因子及血小板衍生生長(zhǎng)因子以可溶解的結(jié)合蛋白形式存在，在軟骨形成和軟骨自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，具有改變椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)變化和阻止椎間盤細(xì)胞凋亡的作用。我們通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞，觀察不同濃度胰島素生長(zhǎng)因子及血小

3、板衍生生長(zhǎng)因子對(duì)髓核細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響及兩者之間的差別，對(duì)進(jìn)一步研究其對(duì)人體椎間盤的影響提供理論依據(jù)。
　　 方法：⑴分離并消化wistar大鼠椎間盤組織得到單個(gè)髓核細(xì)胞并完成原代細(xì)胞接種培養(yǎng)；⑵在原代細(xì)胞融合傳代后建立對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組Ⅰ(1～4組，施加含1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml，1000ng/ml不同濃度胰島素樣生長(zhǎng)因子的DMEM培養(yǎng)液)與實(shí)驗(yàn)組Ⅱ(5～8組，施加含1ng/ml,10ng/

4、ml,100ng/ml，1000ng/ml不同濃度血小板衍生生長(zhǎng)因子的DMEM培養(yǎng)液)；⑶在生長(zhǎng)過(guò)程中使用倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)、增殖的變化；⑷采用HE、甲苯胺藍(lán)染色法觀察傳3代的髓核細(xì)胞的增殖表現(xiàn)，使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組Ⅱ型膠原的表達(dá)情況；⑸采用MTT(噻唑藍(lán)比色)法測(cè)定傳三代空白組和實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ中經(jīng)不同濃度因子刺激生長(zhǎng)后的髓核細(xì)胞3、5、7天的吸光度值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；使用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組中處于S期(DN

5、A合成期)細(xì)胞含量；⑹經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析得出結(jié)論。
　　 結(jié)果：①在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察，10天后95％以上的細(xì)胞貼壁，原代細(xì)胞多為梭形，有偽足伸出；經(jīng)胰酶消化傳代后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)速度加快，而加入胰島素生長(zhǎng)因子及血小板衍生生長(zhǎng)因子刺激生長(zhǎng)的髓核細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖能力明顯增強(qiáng)；②HE染色正常髓核細(xì)胞多呈梭形，胞漿豐富，有2個(gè)胞核。對(duì)照組在不含IGF-1或PDGF-AA刺激下，髓核細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞數(shù)量少，相互交叉連接少。而細(xì)胞形態(tài)的形態(tài)

6、趨向不規(guī)則，胞突明顯延長(zhǎng)，呈細(xì)長(zhǎng)索狀，胞漿含量減少，而IGF-1或PDGF-AA作用組的細(xì)胞，與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)因子組細(xì)胞的形態(tài)在培養(yǎng)早期(＜72h)變化不大，但在培養(yǎng)后期，可見細(xì)胞數(shù)量明顯比對(duì)照組多，細(xì)胞相互交叉呈網(wǎng)狀。細(xì)胞形態(tài)的形態(tài)多為為短梭形、多邊形，胞漿豐富。甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞核為紫色，胞漿染為深藍(lán)色。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。③MTT法顯示吸光度值，第三天時(shí)4組、7組與其余組有差別(p＜0.05)，4、7組無(wú)差別；五

7、天時(shí)對(duì)照組、1、5組與其余各組組均有差別(p＜0.05)，對(duì)照組、1、5組無(wú)差別，7、8組與其他各組有差別(p＜0.05)，7、8組無(wú)差別；七天時(shí)對(duì)照組、1組、5組與其余各組組均有差別(p＜0.05)，對(duì)照組、1、5組無(wú)差別，2、4、6組與3組有差別(p＜0.05)，2、4、6組無(wú)差別，7、8組與其他各組有差別(p＜0.05)，7、8組有差別(p＜0.05)。④經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，生長(zhǎng)因子的濃度與處于S期的細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　

8、 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)為髓核細(xì)胞的培養(yǎng)提供了簡(jiǎn)單、有效的方法。髓核細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)及血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF-AA)能有效促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖，且在有效濃度范圍內(nèi)，隨著濃度不斷增加，促進(jìn)增殖作用顯著增加，細(xì)胞代謝與因子濃度呈線性關(guān)系。而在這兩種細(xì)胞因子的刺激比較中，在低濃度的情況下，PDGF-AA對(duì)細(xì)胞的促進(jìn)作用與IGF-1無(wú)差別，但在高濃度的時(shí)候，培養(yǎng)初期無(wú)差別，而到培養(yǎng)后期的時(shí)候，PDGF-AA對(duì)細(xì)胞的