河南省豬瘟流行病學(xué)調(diào)查及E2基因DNA疫苗的研究.pdf

1、針對頻繁出現(xiàn)的弱毒疫苗免疫失敗現(xiàn)象，本研究通過對河南省豬瘟流行病學(xué)調(diào)查和對流行株的分析，試圖從病毒分子水平，比較流行毒株與疫苗株的分子差異，并企圖研制出針對CSF的高效安全的E2 DNA疫苗，為徹底消滅豬瘟提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。主要試驗(yàn)和結(jié)果如下： 1．豬瘟流行病學(xué)調(diào)查。從2005年1月至2006年12月，在河南省9個(gè)地市的不同豬場收集疑似豬瘟病例379份，通過兔體交互試驗(yàn)、抗原檢測試劑盒方法確定豬瘟病例181份，豬瘟陽性率占

2、發(fā)病豬平均為47.76％。調(diào)查結(jié)果顯示，不同地區(qū)不同豬場，豬瘟占發(fā)病豬的比例不同，以洛陽(83.87％)駐馬店(67.86％)占發(fā)病豬的比例較高，其次是許昌(59.38％)和新鄉(xiāng)(58.33％)。兩種檢測方法的結(jié)果基本一致，說明豬瘟在豬病中所占比例是最高的，是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疾病。對隨病料收集到的河南省CSF流行病學(xué)原始資料進(jìn)行整理、歸納和總結(jié)。文章討論了豬瘟發(fā)生的原因，并提出了防治建議。 2．E2基因的克隆與分析比較。采用

3、RT-PCR和nPCR擴(kuò)增出4株河南近期(2005-2006年)豬瘟流行野毒的E2基因，將其分別克隆于pGEM-T載體并進(jìn)行核苷酸序列測定。根據(jù)C-株、Brescia和Alfort株確定起始氨基酸三聯(lián)體的正確位置后進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，同時(shí)進(jìn)行了同源性比較，繪制了系統(tǒng)關(guān)系發(fā)生樹。結(jié)果表明，所測4個(gè)分離株的CSFV E2基因的長度均為1128 bp，編碼的氨基酸序列均包括完整信號肽序列和部分跨膜序列，共由376個(gè)氨基酸殘基組成。4個(gè)分離株之

4、間E2基因的核苷酸序列同源性為89.3％～99.9％，所推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為91.5％～99.7％。4個(gè)分離株E2基因與C株疫苗毒E2基因的核苷酸序列同源性為82.6％～83.2％，所推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為88.1％～89.9％，這說明發(fā)生在河南省的豬瘟毒株與C疫苗株的E2蛋白之間存在一定差異。 3．DNA疫苗的構(gòu)建。豬瘟病毒HNXX株E2基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA4.0的CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成pcDNA4.0-E

5、2豬瘟DNA疫苗。采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，用熒光染色鑒定和FACS檢測細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的目的蛋白。試驗(yàn)結(jié)果顯示，CSFV E2囊膜蛋白在293T細(xì)胞膜上進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)。 4．動(dòng)物試驗(yàn)。用構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA40-E2免疫Balb/c小鼠、家兔和仔豬。用ELISA方法檢測小鼠血清中抗E2蛋白的抗體，家兔用兔體交互試驗(yàn)檢測中和性抗體，并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，免疫仔豬用ELISA方法檢測抗體，并進(jìn)行本動(dòng)物攻毒試驗(yàn)。