神經酰胺代謝酶抑制劑對其含量的影響及鞘磷脂酶在雙氧化酶1激活中的作用.pdf

1、隨著科技的發(fā)展,鞘脂從最初的被認為僅具有形成細胞膜結構的功能,到現(xiàn)在被證實是具有廣泛生理活性的中介物,參與著細胞內各種信號傳遞和轉導。而細胞內鞘脂代謝的中心分子神經酰胺,也越來越受到科學家們的關注。神經酰胺是細胞內重要的第二信使,近年來,關于神經酰胺在各種疾病中的研究急劇增多。
　　神經酰胺可由酸性鞘磷脂酶(ASMase)水解鞘磷脂產生,同時,也可被神經酰胺酶分解為鞘氨醇、在鞘磷脂合成酶的作用下轉化生成鞘磷脂;在細胞內,神經酰胺與

2、鞘磷脂和鞘氨醇存在動態(tài)平衡的關系,其中一種物質的生成直接或間接影響另外兩種物質的水平。脂筏是一種位于細胞膜上的單位體,它是一些富含膽固醇和鞘脂的微區(qū)域,像小筏一般漂浮于流動的細胞膜中,故稱之為“脂筏”。當細胞受到某種刺激時,脂筏被鞘磷脂酶激活并釋放出大量由鞘磷脂水解而來的神經酰胺,神經酰胺由于氫鍵作用相互聯(lián)接形成微區(qū),微區(qū)之間又可以迅速連接,形成一個或幾個平臺區(qū)。這些富含神經酰胺的脂筏平臺區(qū)廣泛地參與胞內各種信號轉導及蛋白質轉運。

3、>　　近期研究發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生與脂質代謝異常特別是鞘磷脂、神經酰胺的異常密切相關,氣道炎癥如支氣管哮喘的發(fā)生也與脂筏通路的激活息息相關。基于此,本研究擬觀察,在給予神經酰胺干擾劑后,神經酰胺的水平是否發(fā)生變化,為下一步觀察低密度脂蛋白(LDL)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在血管內皮細胞中的穿胞(transcytosis)是否隨著神經酰胺含量的變化而發(fā)生改變奠定檢測學的基礎。另外,我們還通過轉染特異性siRNA進入

4、細胞,特異性抑制氣道上皮細胞中與炎性反應密切相關的雙重氧化酶(Duox1)和與脂筏激活、神經酰胺產生相關聯(lián)的酸性鞘磷脂酶的蛋白表達,觀察活性氧生成量的變化和核轉錄因子 NF–κB活性的改變,來觀察Duox1的活化是否依賴于脂筏-神經酰胺通路的激活。
　　這些研究有助于我們更多地了解脂筏-神經酰胺通路在細胞分子水平中的各種作用及機制。
　　文章從以下兩部分就神經酰胺代謝酶抑制劑對其含量的影響及鞘磷脂酶在雙氧化酶1激活中的作用進

5、行了綜述。
　　第一部分神經酰胺代謝酶抑制劑對其含量的影響
　　目的:觀察神經酰胺干擾劑 Myriocin、D609、NOE和L-carnitine對人臍靜脈內皮細胞中神經酰胺含量的影響。
　　材料和方法:1、培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞,利用細胞計數(shù)試劑盒(Cell counting kit-8, CCK-8),測定不同處理組的人臍靜脈內皮細胞活性;2、提取脂質,利用高效液相色譜-質譜聯(lián)用方法(HPLC-MS/MS)檢測不同

6、處理組的人臍靜脈內皮細胞中神經酰胺水平的變化。
　　結果:1.根據(jù) CCK-8試驗結果選擇對細胞基礎生理活性無明顯影響的藥物濃度Myriocin(30μmol/L)、D609(30μmol/L)和NOE(10μmol/L)、L-carnitine(5mmol/L)來進行實驗,以期各種藥物對相應酶的活性達到最佳抑制效果而對細胞的正常生理活性無明顯影響。2、HPLC-MS/MS結果發(fā)現(xiàn),在上述藥物濃度下,神經酰胺從頭合成抑制劑 Myr

7、iocin使細胞內神經酰胺含量明顯減少(P<0.05);而神經酰胺酶抑制劑 NOE和鞘磷脂合成酶抑制劑 D609均使細胞內神經酰胺含量明顯增加(P<0.05);而酸性鞘磷脂酶抑制劑 L-carnitine使細胞內神經酰胺含量明顯增加(P<0.05)。
　　結論:建立了細胞內神經酰胺含量測定的高效液相色譜-質譜測定法,研究了神經酰胺代謝酶抑制劑對細胞內神經酰胺含量的影響,為進一步研究神經酰胺代謝酶抑制劑的藥理作用打下基礎。
　

8、　第二部分鞘磷脂酶在雙氧化酶激活中作用
　　目的:雙氧化酶Duox1是氣道上皮細胞中NADPH氧化酶(NADPH oxidase,Nox)的主要亞型,在氧分子的參與下,能夠直接催化其底物產生過氧化氫,引起細胞生理和病理反應。由于脂筏來源的神經酰胺在Nox的激活中發(fā)揮十分關鍵的作用,本實驗通過干擾脂筏-神經酰胺轉化的關鍵酶,酸性鞘磷脂酶,來觀察和探討 Duox1的激活是否也依賴于脂筏來源的神經酰胺。
　　方法:設計合成ASM酶