酸性鞘磷脂酶在化療藥物導致卵巢功能損傷中作用的研究.pdf

1、隨著醫(yī)療水平的提高及更早期的診斷，癌癥患者的生存期也得到相應延長。尤其是兒童期的癌癥，預后有極大的提高，如今有>70﹪的兒童期癌癥患者有可能被治愈。在美國，每年大約有4000名青春期前女性因不同的兒童期惡性腫瘤接受化療或放療，而卵巢早衰(POF)是化療和放療伴隨產(chǎn)生的最普遍的遠期后果。 因從胚胎期始女性的卵巢內(nèi)生殖細胞數(shù)目即是有限且不可再生的，卵巢功能的損傷呈漸進性加重趨勢且不可逆轉(zhuǎn)。卵巢功能不足會造成月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、第二性征不

2、發(fā)育或發(fā)育遲緩、不孕、早絕經(jīng)、心血管系統(tǒng)疾病以及骨質(zhì)疏松等，嚴重影響其生活質(zhì)量，故女性腫瘤患者放化療過程中卵巢生殖和內(nèi)分泌功能損傷成為臨床工作亟待解決的難題。 近年來關(guān)于卵巢功能的保護取得了一定進展，目前主要方法有：冷凍卵母細胞，冷凍胚胎，贈卵及冷凍卵巢皮質(zhì)。但每一種方法均存在一定局限性，且只能解決生育問題，對于內(nèi)分泌功能缺失的彌補則不能實現(xiàn)。卵巢的移植則由于局部缺血-再灌注損傷等原因，遠期療效不佳。而對于如何降低抗腫瘤治療所導

3、致的卵泡丟失，實現(xiàn)在體卵巢功能的保存，值得進一步探索研究。 化療藥物殺傷細胞可能主要通過兩種途徑：一種為干擾正常的細胞生長增殖周期。另外一種已被廣泛接受的途徑則是誘導細胞凋亡。由于出生后卵母細胞停滯于減數(shù)分裂Ⅰ期，不具有有絲分裂活性，化療藥物通過介入干擾細胞增殖產(chǎn)生卵巢毒性的比例應相對較小，即促凋亡途徑而非抗有絲分裂途徑，是化療藥物導致卵巢功能損傷的主導途徑，而近年來的研究已經(jīng)證實這一觀點。且越來越多的研究顯示，神經(jīng)酰胺作為細胞

4、內(nèi)信號傳導的第二信使，在調(diào)節(jié)卵母細胞及顆粒細胞凋亡起著重要作用。 神經(jīng)酰胺可由絲氨酸與棕櫚酰輔酶A從頭合成，亦可以在鞘磷脂酶(SMase)催化下由神經(jīng)鞘磷脂的水解生成。由鞘磷脂酶催化水解生成的神經(jīng)酰胺很久以來已被證實與信號傳導功能相關(guān)。酸性鞘磷脂酶(acid sptlingomyelinase，ASMase)，作為SMase最重要的一個亞型，在參與信號傳導并調(diào)節(jié)細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。 ASMase是一種可溶性糖

5、蛋白，主要分布于溶酶體。在一定的外源性刺激下，如細胞因子，離子輻射，熱休克，化療藥物，受體特異性配體作用，環(huán)境因素如壓力，缺血一再灌注等，ASMase可迅速活化，分泌釋放到細胞表面，水解細胞膜上鞘磷脂的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿。神經(jīng)酰胺可以作用于細胞凋亡過程中的多個位點，可通過SAPK/JNK信號傳導通路，亦可作用于蛋白激酶C(PKC)等，影響其下游的酶反應，通過多種信號傳導通路產(chǎn)生生物作用，促進細胞凋亡。這種鞘磷脂酶-神經(jīng)酰

6、胺途徑介導的信號傳導已被證實是廣泛存在的。 2000年Motita等人使用ASMalSe表達基因(SMPDl)敲除的小鼠與野生型小鼠比較發(fā)現(xiàn)，前者具有更多的卵泡儲備，并且在體外實驗中，SMPD1/-的小鼠卵母細胞幾乎可以完全抵抗化療藥物多柔比星(doxorubicin，DXR)所導致的損傷，而選擇性的神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑煙曲霉素B1(FLlmorlisin B1)不能減少卵母細胞凋亡。而由此認為ASMase水解膜磷脂生成神經(jīng)酰胺

7、在DXR所導致的卵母細胞的凋亡中起到主導作用。 環(huán)磷酰胺(Cyclop}lOSphamid，CTX)，與DXR同屬于非細胞周期特異性DNA損傷性化療藥物，其屬于烷化劑類，導致卵巢功能損傷的風險性最高。2005年DesmelJles P的體外實驗研究顯示在較小的始基卵泡中，CTX活性代謝物毒性作用的靶細胞主要為卵母細胞，而在較大的初級卵泡中，顆粒細胞則是主要的作用靶細胞。而使用CTX導致的卵泡損傷是否通過ASMase-神經(jīng)酰胺途

8、徑介導，目前國內(nèi)外均無相關(guān)研究。 上述研究均為體外培養(yǎng)細胞的處理，那么在在體情況下，使用化療藥物刺激后，ASMase的表達是否有改變呢?本研究以育齡期雌性BALB/C小鼠為對象，分組使用化療藥物DXR、CTX、生理鹽水處理后取卵巢組織評估比較化療后ASMase表達情況，并在化療同時使用或不使用ASMase抑制劑-去甲丙咪嗪(desipramine，DP)處理小鼠后，取卵巢組織，比較卵母細胞及顆粒細胞的凋亡情況，以期能初步探討使

9、用這兩種藥物在體化療過程中，ASMase在卵母細胞及顆粒細胞凋亡中的意義，為探索卵巢功能保護相關(guān)治療提供新的位點。 材料與方法 1.實驗動物健康性發(fā)育成熟未交配過的SPF級雌性BALB/C小鼠，體重20-21克，由中山大學實驗動物中心提供。動物質(zhì)量合格證號：2006A003。給予標準光照(14h光照、10h黑夜)、室內(nèi)溫度(20±2)℃、濕度40﹪～50﹪、標準飼料和水，飼養(yǎng)三周開始試驗。飼養(yǎng)期間，觀察其體態(tài)正常，毛色健

10、康，無行為異常者方可進行實驗。開始實驗時，小鼠周齡為9-11周。 2.實驗方法 將36只雌性BALB/C小鼠隨機分成6大組：A組為DXR組，6只，單劑量腹腔注射10mg/kgDXR；B組為DXR+去甲丙咪嗪組6只，單劑量腹腔注射10mg/kg DXR+10mg/kg去甲丙咪嗪(使用DXR前)；C組為CTX組，6只，單劑量腹腔注射75mg/kgCTX；D組為CTX+去甲丙咪嗪組，6只，單劑量腹腔注射75mg/kgCTX+1

11、0mg/kg去甲丙咪嗪(使用CTX前)；E組為去甲丙咪嗪組，6只，單劑量腹腔注射10mg/kg去甲丙咪嗪；F組為生理鹽水組，6只，單劑量腹腔注射0.1ml生理鹽水。24小時后，取雙側(cè)卵巢系列切片，其中A，C，F(xiàn)組取組織切片使用免疫組織化學法半定量檢測并比較ASMa．se的表達情況，A，B，C，D，E，F(xiàn)組均行TUNEL法檢測卵母細胞及顆粒細胞凋亡情況。 結(jié)果 六組實驗小鼠使用上述藥物處理24小時后均存活。 1.

12、卵巢組織ASMase免疫組化檢測結(jié)果．(A組，C組，F(xiàn)組)可見生理鹽水處理組小鼠卵巢各級卵母細胞及部分顆粒細胞胞漿胞膜著色，呈淡黃色。DXR及CTX組組卵母細胞胞漿及胞膜著色明顯加深，顆粒細胞表達陽性者較生理鹽水組增加，呈棕黃色，其中晚期生長卵泡及竇卵泡著色相對原始卵泡及早期生長卵泡深。統(tǒng)計結(jié)果DXR組ASMase表達高于NS組，差別具有統(tǒng)計學意義(Z=2.226，P=0.026)；CTX組ASMase表達亦高于NS組，差別具有統(tǒng)計學意

13、義(Z=2.121，P=0.034)。DXR組及CTX組卵巢組織均可見間質(zhì)組織ASMase呈強陽性表達。 2.卵巢組織TUNEL法檢測細胞凋亡結(jié)果：(A組，B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組)可見卵泡中凋亡陽性細胞核可見較多的深棕色細顆粒狀物質(zhì)并且非常致密，同期所設(shè)陰性對照中胞核為蘇木素染成藍色。統(tǒng)計結(jié)果示DP組與NS組間各級卵泡細胞凋亡率均無明顯差異(P>0.05)，鑒于DP組及NS組卵母細胞凋亡數(shù)目少，未納入統(tǒng)計結(jié)果。

14、 a.DXR組小鼠原始卵泡中卵母細胞凋亡最劇(63.73﹪)，其次為初級卵泡(60.88﹪)，次級卵泡最少(46.78﹪)。各級卵泡中顆粒細胞凋亡率數(shù)值相近。DXR+DP組各級卵泡卵母細胞凋亡率及顆粒細胞凋亡率較DXR組均有下降，統(tǒng)計學分析示差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DXR+DP組原始卵泡及初級卵泡顆粒細胞凋亡率仍較NS組，DP組偏高，差別均具有統(tǒng)計學意義。次級卵泡顆粒細胞凋亡率三組數(shù)值近似，差別無明顯統(tǒng)計學意義。 b

15、.CTX組中原始卵泡及初級卵泡中卵母細胞凋亡較嚴重，凋亡率達到75.55﹪及65.16﹪，顆粒細胞凋亡則相對較輕；而在次級卵泡中卵母細胞凋亡率僅為37.48﹪，顆粒細胞凋亡率較原始卵泡及初級卵泡高。 CTX+DP組各級卵泡中卵母細胞凋亡率與CTX組相比較均有所降低，原始卵泡及初級卵泡中分析結(jié)果示有統(tǒng)計學學差異((P<0.05)，而在次級卵泡中，P>0.05，差別不具有統(tǒng)計學意義。CTX+DP組各級卵泡顆粒細胞凋亡率較CTX組均有降低，統(tǒng)

16、計結(jié)果示有統(tǒng)計學學差異((P<0.05)。CFX+DP組各級卵泡顆粒細胞凋亡率較NS組及DP組均有升高，統(tǒng)計結(jié)果示有統(tǒng)計學學差異((P<0.05)。 結(jié)論 1.化療藥物DXR，CTX可導致小鼠卵巢卵母細胞及顆粒細胞凋亡。 2.使用化療藥物DXR或CTX的實驗組，卵巢組織ASMase的表達較生理鹽水組有升高，提示該兩種藥物可使ASMase表達上調(diào)。 3.使用去甲丙咪嗪在體抑制ASMase作用后，DXR導致