益腎活血膠囊對高同型半胱氨酸血癥所致兔動脈粥樣硬化相關炎癥因子表達調節(jié)的研究.pdf

1、本研究以高蛋氨酸飲食誘導兔高Hcy血癥并制備AS動物模型，以降低血漿Hcy水平的常用藥物葉酸、VitB6、VitB12聯合治療作為陽性對照，通過對高Hcy血癥所致AS兔腹主動脈內膜、中膜病理改變及超微結構的觀察，以及應用熒光實時定量PCR和免疫組化技術檢測ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9mRNA及蛋白表達的改變，并用Western blot和免疫組化檢測NF-kB抑制因子-a蛋白表達及NF-κB核移位的變化，探討益腎活

2、血膠囊對Hcy所致血管壁炎癥的抑制作用，為其臨床防治高Hcy血癥及AS提供科學依據。 目的：觀察益腎活血膠囊對高Hcy血癥所致AS兔血漿Hcy水平、腹主動脈壁形態(tài)學及超微結構的改變、血管壁炎癥因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9基因和蛋白表達的變化、以及對NF-κB活化的影響，探討益腎活血膠囊對高Hcy血癥及其所致AS的防治作用及機理。 方法： 1.試驗動物：2-3月齡、體重2.0-2.5 kg

3、雄性純種新西蘭兔。 2.建立模型：以充盈球囊損傷腹主動脈內膜后，2％高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)動物5個月，建立高Hcy血癥及AS動物模型。 3.動物分組：將56只新西蘭兔隨機分為正常組、模型組、益腎活血膠囊預防組、益腎活血膠囊小劑量組、益腎活血膠囊中劑量組、益腎活血膠囊大劑量組、西藥對照組，共7組。 4.觀察指標：(1)高效液相色譜技術檢測各實驗組兔血漿Hcy濃度；(2)腹主動脈壁病理學觀察；(3)腹主動脈壁形態(tài)學指標檢測

4、：平均內膜厚度、中膜厚度、內膜面積、內膜面積與中膜面積比；(4)透射電鏡觀察腹主動脈壁中膜平滑肌細胞超微結構；(5)實時定量RT-PCR法檢測腹主動脈ICAM-1、MCP-1、FGF-β1和MMP-9的mRNA表達；(6)免疫組化法觀察ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9的蛋白表達；(7)NF-κB活化情況檢測：Westernblot檢測IκB-a蛋白表達及免疫組化法檢測NF-κB核表達情況。 結果： 1.

5、各實驗組兔血漿Hcy濃度變化與正常對照組相比，模型組兔血漿Hcy濃度明顯升高；各藥物處理組兔血漿Hcy濃度較模型組均有不同程度下降，其中預防組下降最為顯著，其次為大劑量組；預防組和大劑量組與西藥對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義；小劑量組和中劑量組與西藥對照組相比差異無顯著性。 2.腹主動脈壁切片光鏡下HE染色觀察正常對照組兔腹主動脈血管壁內膜、中膜、外膜三層結構明顯，內膜完整、無增厚，內皮下無脂質沉積，中膜VSMCs細長呈梭形，細

6、胞核藍染，同心圓狀排列整齊；模型組兔腹主動脈壁內膜明顯增厚，內皮下可見泡沫細胞聚集，中膜VSMCs排列紊亂，單位面積細胞核數量增多；預防組及各藥物治療組兔腹主動脈內膜增厚與模型組相比均有所減輕，中膜VSMCs排列欠規(guī)則，單位面積細胞核數目略增多。 3.腹主動脈形態(tài)學指標比較3.1內膜厚度比較：與正常對照組相比，模型組兔腹主動脈IT明顯增加；與模型組相比，各藥物處理組腹主動脈IT均有不同程度下降，其中預防組和大劑量組下降尤為明顯，

7、但是西藥對照組和小劑量組IT與模型組相比，差異無顯著性；預防組和大劑量組IT與西藥對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。 3.2中膜厚度比較：與正常對照組相比，模型組及各藥物組兔腹主動脈MT雖有不同程度增加，但差異無顯著性。 3.3內膜面積比較：與正常對照組相比，模型組兔腹主動脈IA明顯增加；與模型組相比，各藥物處理組IA均有所下降，其中預防組和大劑量組下降尤為明顯，然而西藥對照組IA與模型組相比，差異無顯著性；預防組IA與西

8、藥對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。 3.4內膜與中膜面積比(IA/MA)：與正常對照組相比，模型組兔腹主動脈IA/MA顯著增加(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組兔腹主動脈IA/MA均明顯下降(P均＜0.05)；預防組、大劑量組與西藥對照組相比差異具有顯著性(P均＜0.05)。 4.腹主動脈壁中膜平滑肌細胞超微結構改變正常組兔血管中膜平滑肌細胞呈紡錘形，密斑密體排列規(guī)則，肌絲含量豐富，線粒體、內質網無腫脹，呈典型

9、的收縮型細胞特征；模型組可見血管平滑肌細胞向內膜遷移，核固縮，肌絲減少，線粒體明顯腫脹，呈空泡狀，粗面內質網、核糖體和高爾基體等細胞器增多，呈明顯的合成型細胞特征；益腎活血膠囊不同處理組，中膜平滑肌細胞形態(tài)均有不同程度的改善，與模型組相比，線粒體腫脹減輕，密斑密體可見，肌絲含量增加，恢復收縮型細胞特征；西藥對照組平滑肌細胞形態(tài)改善不明顯。 5.腹主動脈壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9mRNA表達水平比較(1)

10、 ICAM-1mRNA表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁ICAM-1mRNA表達顯著升高(P＜0.01)；各藥物處理組ICAM-1 mRNA表達較模型組均有不同程度下降，其中預防組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為大劑量組(P＜0.01)，小劑量組ICAM-1mRNA表達與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；預防組和大劑量組與西藥對照組相比差異具有顯著性(P均＜0.05)。 (2) MCP-1mRNA表達比較

11、：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MCP-1mRNA表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MCP-1mRNA表達均顯著下降(P均＜0.05)；預防組、中劑量組和大劑量組與西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。 (3) TGF-β1mRNA表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁TGF-β1mRNA表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組TGF-β1mRNA表達均明顯下降(P均＜0

12、.05)；預防組與西藥對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 (4) MMP-9mRNA表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MMP-9mRNA表達明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MMP-9mRNA表達均顯著下降(P均＜0.01)；預防組和大劑量組與西藥對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。 6.腹主動脈壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9蛋白表達水平比較(1)

13、 ICAM-1蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁ICAM-1蛋白表達顯著升高(P＜0.01)；小劑量組和西藥對照組兔ICAM-1蛋白表達與模型組相比，差異無顯著性(P＞0.05)，預防組、中劑量組和大劑量組則較模型組明顯下降(P均＜0.05)；預防組和大劑量組兔ICAM-1蛋白表達明顯低于西藥對照組，也顯著低于小劑量組(P均＜0.01)。 (2) MCP-1蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MCP-1蛋白

14、表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MCP-1蛋白表達均明顯下降(P均＜0.01)；預防組和大劑量組與西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 (3)TGF-β1蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁TGF-β1蛋白表達顯著升高(P＜0.01)；小劑量組、中劑量組和西藥對照組兔TGF-β1蛋白表達與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，預防組和大劑量組TGF-β1蛋白表達較模型組明顯下降(

15、P均＜0.01)，且分別顯著低于西藥對照組、小劑量組和中劑量組(P均＜0.05)。 (4)MMP-9蛋白表達比較：與正常對照組相比，模型組兔血管壁MMP-9蛋白表達顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MMP-9蛋白表達均有所下降(P均＜0.05)，其中以大劑量組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為預防組(P＜0.01)；大劑量組和西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 7.腹主動脈NF-kB活

16、化情況比較Western blot分析顯示，模型組兔血管壁IkB-a蛋白表達較正常對照組明顯減少(P＜0.01)，提示高Hcy血癥促進IκB-a蛋白的降解；與模型組相比，各藥物處理組IκB-a蛋白表達均有不同程度的升高，其中以大劑量組回升最為顯著(P＜0.01)，小劑量組IκB-a蛋白表達與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；大劑量組IκB-a蛋白表達與西藥對照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。 免疫組化顯示，模型

17、組兔血管壁NF-κBp65核表達比例較正常對照組明顯增多(P＜0.01)，提示高Hcy血癥促進NF-κB的核移位；與模型組相比，各藥物處理組NF-κB p65核表達比例均有不同程度的下降，其中以預防組下降最為顯著(P＜0.01.)，其次為大劑量組(P＜0.01)；預防組NF-κB p65核表達比例與西藥對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結論： 1.益腎活血膠囊能夠降低實驗兔血漿Hcy水平。 2.益腎