登革病毒2型外膜E蛋白基因DIII區(qū)的表達(dá)及其在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用研究.pdf

1、最近幾十年來(lái),由于全球人口數(shù)量和流動(dòng)性持續(xù)增加,登革熱在全球的流行范圍不斷擴(kuò)大,并已成為目前世界上分布最廣、發(fā)病最多的蟲(chóng)媒病毒病,對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的威脅。由于缺乏疫苗,登革熱的防治一直是世界性難題。除了媒介控制外,感染者的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、隔離以及治療是目前預(yù)防登革熱進(jìn)一步擴(kuò)散的重要手段,因此,早期診斷對(duì)于登革熱的預(yù)防控制至關(guān)重要。
　　登革熱的早期診斷一直是登革熱防治研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),相關(guān)的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)也在不斷發(fā)展,包括病毒核酸檢測(cè)、抗

2、原抗體檢測(cè)在內(nèi)的多種實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)已被應(yīng)用于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)工作。目前,國(guó)外已經(jīng)有多家試劑公司研制成功并推出了包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫層析法(ICT)等在內(nèi)的商品化病毒抗體檢測(cè)試劑盒,此類試劑盒具有快速、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室,特別是基層實(shí)驗(yàn)室所采用。近年來(lái),國(guó)內(nèi)雖然也有不少研究機(jī)構(gòu)開(kāi)展登革病毒抗體檢測(cè)試劑盒的研制,并有相關(guān)研制的報(bào)道,但其實(shí)際應(yīng)用一直沒(méi)有取得突破,試劑的國(guó)產(chǎn)化一直是國(guó)內(nèi)登革熱防控工作的短板。

3、r>　　本課題以登革2型病毒外膜蛋白(envelope,E)為研究對(duì)象,在其編碼基因的DIII區(qū)上下游各設(shè)計(jì)8條引物,分別引入NdeI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn),交叉配對(duì)共擴(kuò)增出64條DIII區(qū)基因片段,利用pET30a(+)表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(DE3)中分別克隆和表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot驗(yàn)證其表達(dá)含量及重組蛋白的免疫反應(yīng)性,篩選表達(dá)量大且有較強(qiáng)免疫反應(yīng)性的重組蛋白抗原進(jìn)行純化并建立間接ELISA法用以檢測(cè)登

4、革熱IgM抗體,為國(guó)產(chǎn)試劑提供候選抗原和方法。
　　為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)建立的ELISA法檢測(cè)效果,我們以Panbio公司生產(chǎn)的登革熱IgM檢測(cè)試劑盒作為對(duì)照,選取112份臨床血清標(biāo)本進(jìn)行了初步的試劑評(píng)估。檢測(cè)結(jié)果表明,以IFA檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),本研究ELISA法檢測(cè)IgM的靈敏度為94.64％,特異度為91.07%;與Panbio公司生產(chǎn)試劑盒相比,本研究建立的ELISA法檢測(cè)登革病毒IgM抗體的檢測(cè)陽(yáng)性符合率為92.85%,陰性符合率為