重組蛋白TP17、TP47的原核表達及其在梅毒血清學(xué)診斷中的初步應(yīng)用.pdf

1、研究背景:
　　梅毒(Syphilis)是由蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)感染所引起的性傳播疾病(STD,Sexually transmitted diseases)。該病對人體具有多重的危害,其病原體能夠侵犯皮膚黏膜、淋巴結(jié)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng),從而造成組織損傷和多器官功能障礙,還可以通過母嬰垂直傳播,導(dǎo)致先天性梅毒的發(fā)生,造成早產(chǎn)、流產(chǎn)或死胎,嚴(yán)重影響出生人口的質(zhì)量,同時,梅毒疾病在HIV的感染和致病等

2、過程中也具有一定的促進作用。在建國初期,梅毒疫情曾一度被消滅,自上世紀(jì)80年代后,隨著人們生活方式的改變以及人口流動的增加,梅毒疫情在我國呈現(xiàn)復(fù)發(fā)趨勢,其年發(fā)病數(shù)約40萬,居乙類傳染病第三位,僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核。為了控制梅毒疫情的擴散,臨床的早期診斷和規(guī)范治療具有重要意義。
　　目前,梅毒病原體尚無理想的體外培養(yǎng)方法,臨床上用于梅毒診斷的方法主要包括暗視野顯微鏡檢查和血清學(xué)試驗。前者受制于疾病病期、標(biāo)本類型和檢測儀器等因素的

3、影響,對于沒有明顯癥狀或體征的患者缺乏適用性,臨床應(yīng)用并不廣泛;后者則是梅毒實驗室診斷的主要方法,是臨床確診的重要參考依據(jù)。近年來,梅毒血清學(xué)試驗發(fā)展迅速,利用基因工程重組抗原所建立的檢測方法呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景,其中,以酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化學(xué)發(fā)光法(Chemiluminescence test,CMIA)最具代表性,這類方法雖能夠?qū)崿F(xiàn)自動化檢測,具有較高

4、的敏感性和特異性,但仍然存在一定局限性,對于梅毒感染早期的患者,可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果;與經(jīng)典的TPPA法檢測結(jié)果存在矛盾的情況,因此,優(yōu)化和完善梅毒的血清學(xué)試驗對于提高該病的診斷效率具有重要意義。TP17、TP47蛋白是梅毒螺旋體的特異性脂蛋白,具有較強的免疫原性和免疫反應(yīng)性,是梅毒診斷試劑中最為重要的兩種抗原,這兩種蛋白的鑒定和評估,是優(yōu)化和完善現(xiàn)有的梅毒血清學(xué)試驗的重要途徑。
　　目的:
　　1.通過原核基因工程技術(shù)克隆表

5、達梅毒螺旋體TP17、TP47蛋白,建立重組蛋白克隆表達和純化的工藝,為評估這兩種蛋白在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值提供物質(zhì)前提,也為未來鑒定新的重組蛋白奠定基礎(chǔ);
　　2.建立基于TP17、TP47蛋白的間接ELISA檢測方法,初步探討這兩種蛋白在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值,為進一步優(yōu)化和完善現(xiàn)有的血清學(xué)診斷方法,開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新一代梅毒診斷試劑提供重要的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.應(yīng)用PCR擴增梅毒螺旋體

6、TP17、TP47基因,構(gòu)建原核表達載體pET-28b-TP17和pET-28b-TP47,通過酶切分析和測序來鑒定重組質(zhì)粒;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,以IPTG誘導(dǎo)表達,使用鎳離子親和層析柱來純化重組蛋白;
　　2.利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALD

7、I-TOF-MS)技術(shù),以獲得重組蛋白的肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting,PMF),將圖譜數(shù)據(jù)在NCBInr、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中進行檢索比對,以鑒定重組蛋白;
　　3.將重組蛋白進行SDS-PAGE分析,電泳后的凝膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,以臨床收集的TPPA結(jié)果陽性的混合血清作為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗,進行免疫印跡分析;
　　4.以重組蛋白TP17、TP47作為

8、包被抗原,建立間接ELISA檢測方法,通過實驗確定最佳的抗原包被條件和封閉方式、最佳的包被抗原濃度、酶標(biāo)二抗稀釋度、最適的血清反應(yīng)時間以及顯色時間等條件;
　　5.以建立的間接ELISA法來檢測臨床收集的126份血清標(biāo)本,評估方法的檢測性能,并探討TP17、TP47蛋白在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。
　　結(jié)果:
　　1.PCR擴增獲得梅毒螺旋體TP17、TP47基因,構(gòu)建的原核表達載體pET-28b-TP17和pET-

9、28b-TP47測序結(jié)果表明,克隆基因的核酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的序列完全一致;
　　2.重組工程菌在IPTG的誘導(dǎo)下進行表達,分別獲得分子量約為20kDa和42kDa的包涵體蛋白,利用親和層析技術(shù)成功獲得純度較高的重組蛋白;
　　3.MALDI-TOF-MS和免疫印跡鑒定表明,誘導(dǎo)表達的重組蛋白正是梅毒螺旋體TP17和TP47蛋白,兩種蛋白均能夠與TPPA結(jié)果陽性的混合血清發(fā)生特異性反應(yīng),與TPPA結(jié)果陰性的血

10、清不發(fā)生反應(yīng);
　　4.建立了基于TP17、TP47的間接ELISA檢測方法,其最佳抗原包被條件為直接4℃過夜,最佳封閉方式為1％BSA在37℃孵育4h,然后4℃過夜,最佳抗原包被濃度分別為2μg/ml(TP17)和4μg/ml(TP47),最佳的二抗稀釋度為1:20000,最佳的血清反應(yīng)時間分別為30min(TP17)和45min(TP47),最佳的顯色時間分別為15min(TP17)和20min(TP47);
　　5.基

11、于TP17的ELISA間接法的檢測敏感性和特異性分別為100%和98.1%,與TPPA和CMIA的檢測符合率均為99.2%(125/126);基于TP47的ELISA間接法的檢測敏感性和特異性分別為95.8%和96.3%,與TPPA和CMIA的檢測符合率均為96.0%(121/126)。
　　結(jié)論:
　　1.基于pET-28b載體和E.coli BL21宿主菌的原核表達系統(tǒng)能夠使TP17、TP47基因獲得高效表達;