Babesia gibsoni AMA-1基因的克隆和表達(dá)及其血清學(xué)診斷上的研究.pdf

1、本文通過(guò)B.gibsoni感染狗血清對(duì)由B.gibsoni裂殖子構(gòu)建的cDNA基因表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，其中獲得的27個(gè)陽(yáng)性克隆是編碼同一蛋白的cDNA。經(jīng)過(guò)核苷酸序列分析，發(fā)現(xiàn)這些cDNA不完整，缺乏5′端的基因。于是，采用PCR方法從cDNA文庫(kù)擴(kuò)增含5′端的cDNA。獲得完整的基因序列后，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，顯示，整個(gè)基因長(zhǎng)度是2，108bp，其中包括一個(gè)長(zhǎng)度為1，764bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼分子量約為62kDa大小的一條多肽鏈。通

2、過(guò)BLAST，提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，顯示這條多肽鏈與已報(bào)道的AMA-1有同源性，特別是與BabesiabovisAMA-1(BbAMA-1)同源性高達(dá)53﹪，我們因此把這條多肽命名為BabesiagibsoniAMA-1(BgAMA-1)。為了進(jìn)一步研究BgAMA-1，構(gòu)建了BgAMA-1基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21中以GST-BgAMA-1融合蛋白形式進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示：GST蛋白(空白對(duì)照)和重組融合蛋白G

3、ST-BgAMA-1的大小與預(yù)期的相符，分別為26kDa和88kDa。Westernblot分析表明，重組抗原BgAMA-1能特異性吸附B.gibsoni感染犬血清中的某種抗體，呈現(xiàn)特有的反應(yīng)帶，而相應(yīng)的對(duì)照組GST無(wú)特異性反應(yīng)出現(xiàn)。初步推斷，BgAMA-1為B.gibsoni所特有的抗原。以重組蛋白BgAMA-1作為診斷抗原的ELISA試驗(yàn)中，能區(qū)分B.gibsoni感染犬血清和SPF犬血清，且與其他Babesia屬?zèng)]有出現(xiàn)交叉反應(yīng)現(xiàn)