影像膠質(zhì)瘤預(yù)后免疫反應(yīng)的相關(guān)因子研究.pdf

1、研究背景和目的:膠質(zhì)瘤是成人顱腦腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，發(fā)生率約占顱內(nèi)腫瘤的35.12-61.10％。其生長迅速，具有很強(qiáng)的侵襲性，目前為止，各種手術(shù)方法都無法做到腫瘤的完全切除。另外，由于血腦屏障的存在，使得目前諸多的治療方法諸如化療或者放療等都難以取得令人滿意的治療效果。即使進(jìn)行系統(tǒng)的治療，患者也往往在術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)。因此，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后非常差，中位生存期只有12-18個(gè)月，長期存活的病例非常罕見。由于大腦淋巴系統(tǒng)非常不發(fā)達(dá)以

2、及完整的血腦屏障對(duì)炎癥細(xì)胞的阻礙作用等，大腦一直以來被認(rèn)為是免疫豁免器官。但是最近的研究表明，在健康人和炎癥狀態(tài)下，大腦的免疫監(jiān)督是存在的，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞降低到一定程度時(shí)，人體自身的免疫系統(tǒng)可以殺死殘存膠質(zhì)瘤細(xì)胞，從而減少膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)。雖然巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞具有很強(qiáng)的腫瘤滲透性，但是其在膠質(zhì)瘤中的功能往往是被抑制的。這種抑制作用一般認(rèn)為是由于巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的STAT3信號(hào)通路被膠質(zhì)瘤通過某種途徑激活，從而抑制了免疫細(xì)胞

3、的功能發(fā)揮。但是，膠質(zhì)瘤是如何激活免疫細(xì)胞中的STAT3信號(hào)通路目前為止還不是很清楚。因此，尋找可以激活膠質(zhì)瘤中免疫系統(tǒng)的活性因子，使人體自身的免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常的防衛(wèi)功能，便成為治療腫瘤，改善腫瘤預(yù)后的一種重要方法和途徑。
　　 C-Met屬于跨膜受體蛋白，是一種重要的腫瘤標(biāo)記物，定位于7號(hào)染色體長臂2區(qū)1帶至3區(qū)1帶，橫跨120 Kb。C-Met通過與其配體肝細(xì)胞生長因子(HGF)結(jié)合，對(duì)腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移和預(yù)后起著關(guān)鍵的作用。

4、C-Met在膠質(zhì)瘤，肝癌，結(jié)腸癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)并且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。
　　 S100B是一種Ca2+結(jié)合蛋白，在星形細(xì)胞，成熟少突細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)。人類S100B基因定位于21號(hào)染色體長臂2區(qū)2帶上。S100B通過與其受體RAGE結(jié)合，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞，星形細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞。RAGE信號(hào)通路的激活可以激活STAT3信號(hào)通路。而作為RAGE配體的S100B在膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。已有

5、研究表明，S100B在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可以抑制機(jī)體免疫細(xì)胞的激活，從而降低機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的生長和復(fù)發(fā)。但是，S100B具體通過那些途徑抑制免疫細(xì)胞的激活，以及S100B表達(dá)量與免疫抑制程度的關(guān)系，目前為止還不是十分清楚。
　　 本論文分為兩部分：第一部分：通過對(duì)C-Met與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)性的研究，明確C-Met在膠質(zhì)瘤預(yù)后中所起的重要作用，為以其為靶點(diǎn)改善膠質(zhì)瘤預(yù)后提供依據(jù)。第二部分：通過對(duì)S100B在RAGE和ST

6、AT3信號(hào)通路中的功能研究，明確S100B在兩個(gè)信號(hào)通路中所起的作用，初步闡明S100B通過何種途徑抑制小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞激活的機(jī)制，探討以S100B為靶點(diǎn)，激活顱內(nèi)的免疫系統(tǒng)，從而抑制腫瘤生長，減少腫瘤復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤治療新途徑。
　　 第一部分 c-Met在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤預(yù)后的相關(guān)性研究
　　 目的：通過檢測(cè)初發(fā)和復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者腫瘤標(biāo)本中c-Met的表達(dá)差異，探討c-Met與膠質(zhì)瘤預(yù)后的相關(guān)

7、性。
　　 方法：選取19例山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科收治的復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者為研究對(duì)象。收集患者兩次手術(shù)中膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，利用免疫組織化學(xué)的方法而來檢測(cè)c-Met在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。分析c-Met表達(dá)量的差異與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤無癥狀生存時(shí)間(手術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：c-Met的表達(dá)量在復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中明顯高于初發(fā)患者。
　　 2.在初發(fā)患者里，腫瘤標(biāo)本檢

8、測(cè)c-Met呈高表達(dá)則手術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間明顯短于c-Met低表達(dá)患者。
　　 結(jié)論：復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中c-Met的表達(dá)明顯增大，而且c-Met的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間密切相關(guān)。因此，以c-Met為靶點(diǎn)在膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后判斷上具有重要的臨床意義。
　　 第二部分 S100B在膠質(zhì)瘤中對(duì)顱內(nèi)免疫功能的抑制作用及其在STAT3信號(hào)通路中可能的作用機(jī)制研究
　　 目的：先前的研究表明，RAGE信號(hào)通路的激活

9、可以激活STAT3信號(hào)通路。作為RAGE配體的S100B在膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。因此，假設(shè)膠質(zhì)瘤中巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的激活是由于S100B與其受體RAGE相互作用的結(jié)果。通過對(duì)S100B在RAGE和STAT3信號(hào)通路的研究，明確S100B在兩個(gè)信號(hào)通路中所起的作用，初步闡明S100B通過何種途徑抑制小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞激活的機(jī)制，探討以S100B為靶點(diǎn)，激活顱內(nèi)的免疫系統(tǒng)，從而抑制腫瘤生長，減少腫瘤復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤治療新

10、途徑。
　　 方法：
　　 1.S100B在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及對(duì)RAGE信號(hào)通路的影響
　　 1.1用Elisa方法檢測(cè)S100B在GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)；用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和熒光免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)S100B在膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中的表達(dá)。
　　 1.2用RT-PCR和Western Blotting的方法檢測(cè)GL261細(xì)胞培養(yǎng)液(含有S100B)以及不同濃度的S100B對(duì)N9細(xì)胞系以及原代骨髓

11、單核細(xì)胞中RAGE表達(dá)的影響。
　　 1.3用流式細(xì)胞術(shù)和熒光免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中RAGE的表達(dá)。
　　 2.S100B對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響:用RT-PCR，Western blotting和FCM的方法檢測(cè)GL261細(xì)胞培養(yǎng)液以及不同濃度的S100B對(duì)N9細(xì)胞系以及原代骨髓單核細(xì)胞中STAT3表達(dá)的影響。
　　 3.RAGE信號(hào)通路與STAT3信號(hào)通路的相互聯(lián)系：用RAGE抗體在體內(nèi)和體

12、外分別阻斷RAGE信號(hào)通路，再分別用EMSA，RT-PCR的方法檢測(cè)STAT3信號(hào)通路的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.GL261條件培養(yǎng)基(GCM)可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌RAGE發(fā)現(xiàn)：GCM可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)上調(diào)RAGE的表達(dá)，培養(yǎng)一段時(shí)間后(24-48h)，RAGE水平是下降的。與此同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌性的RAGE蛋白卻是增加的。這種現(xiàn)象可能是由于N9細(xì)胞膜上全長RAGE蛋白的斷裂所致。最后，發(fā)現(xiàn)加入GCM共培養(yǎng)

13、48h后RAGE mRNA的表達(dá)是上調(diào)的。這可能是對(duì)蛋白分泌的補(bǔ)充性上調(diào)。
　　 2.RAGE蛋白在顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：在顱內(nèi)膠質(zhì)瘤中，超過70％的表達(dá)EGFP細(xì)胞為MPs(CD11b+，CD45high)和MG(CD11b+，CD45low)。在載瘤小鼠腦組織和血液中RAGE+CD11b+(MG)細(xì)胞出現(xiàn)的頻率明顯高于正常對(duì)照組老鼠。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：在正常小鼠中，RAGE的表達(dá)很低，但是，在載瘤小鼠的腫瘤

14、邊界周圍RAGE的表達(dá)明顯增多。
　　 3.膠質(zhì)瘤中S100B的表達(dá)將N9細(xì)胞與GCM共培養(yǎng)48h內(nèi)，S100B的分泌量明顯增加。在體內(nèi)試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外間隙中(ECS)都有S100B的表達(dá)。而且，大量的MG/MPs細(xì)胞也都有S100B的表達(dá)。
　　 4.低濃度的S100B可以刺激RAGE的表達(dá)與GCM的作用類似，S100B在低濃度可以上調(diào)RAGE蛋白和mRNA的表達(dá)。但是，高濃度的S100B也可以增

15、加N9細(xì)胞中分泌性RAGE蛋白的表達(dá)。
　　 5.GCM和S100B抑制MAPK的激活和MG細(xì)胞因子的表達(dá)GCM和低濃度的S100B不僅可以抑制N9細(xì)胞里TNF-α和IL-1β的基礎(chǔ)分泌，還可以抑制經(jīng)過LPS刺激后的IL-1β分泌。類似的現(xiàn)象也在BMM細(xì)胞中得到證實(shí)。
　　 6.低濃度的S100B可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中STAT3的表達(dá)與GCM相似，低濃度的S100B可以上調(diào)STAT3和磷酸化的STAT3的表達(dá)。雖然高濃度的

16、S100B也增加了STAT3的轉(zhuǎn)錄，但是卻沒有增加其蛋白表達(dá)。并且對(duì)磷酸化的STAT3的激活作用也相對(duì)溫和。這提示：膠質(zhì)瘤內(nèi)環(huán)境中低濃度的S100B可以通過激活STAT3信號(hào)通路來調(diào)節(jié)MG/MP的炎癥反應(yīng)。
　　 7.阻斷RAGE通路可以抑制STAT3的活性阻斷RAGE通路后可以部分抑制STAT3的表達(dá)和抗炎因子IL-10的表達(dá)。作為對(duì)比的是，用對(duì)照IgG阻斷RAGE從而抑制STAT3的結(jié)果沒有aRAGE明顯。這暗示膠質(zhì)瘤介導(dǎo)的

17、MG/MP中STAT3的激活可能部分是由于對(duì)RAGE信號(hào)通路的調(diào)節(jié)引起的。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，體內(nèi)試驗(yàn)也證實(shí)了aRAGE對(duì)pSTAT3的部分抑制作用。
　　 結(jié)論：體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：膠質(zhì)瘤中MG/MP細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的激活很可能是由于RAGE通路激活引起的。膠質(zhì)瘤可以分泌低濃度的S100B，作為RAGE配體的S100B可以激活STAT3信號(hào)通路從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性。因此，膠質(zhì)瘤中S100B-RAGE的相互作用在S