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文檔簡介
1、目的: 1.研究雷公藤內(nèi)酯醇(TL)對人纖維肉瘤HT-11080細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的影響; 2.研究TL調(diào)控MMP-9表達(dá)的意義; 3.探討TL調(diào)控MMP-9表達(dá)的機(jī)制。 方法: 1.選擇人纖維肉瘤細(xì)胞系HT-1080為研究對象,常規(guī)培養(yǎng)、傳代,藥物的3個(gè)工作濃度分別為6nM、12nM和18nM,處理時(shí)間均為72小時(shí); 2.采用MMT法檢測TL對HT-1080細(xì)胞增殖
2、能力的影響; 3.用流式細(xì)胞儀檢測TL致HT-1080細(xì)胞凋亡情況; 4.運(yùn)用RT-PCR檢測TL對9個(gè)基因mRNA表達(dá)的影響,這些基因是:MMP-9和-2,基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1、-2、-3和-4,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)-1、-3A和-3B; 5.用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測TL對HT-1080細(xì)胞MMP-9和-2活性的影響; 6.用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測TL對HT-1080細(xì)胞體
3、外侵襲能力的影響; 7.用甲基化特異性PCR(MSP)檢測TL對MMP-9基因甲基化水平的影響; 8.用Westem blotting檢測TL對DNMT-1、-3A和一3B蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1.TL作用72小時(shí),隨藥物濃度的增加,HT-1080細(xì)胞的增殖逐漸受到抑制;其中,半數(shù)抑制濃度約為25nM; 2.濃度分別為6nM、12nM和18nM的TL處理72小時(shí)后,HT-1080細(xì)胞的凋亡率分
4、別為16.0%、17.3%和18.8%,對照組凋亡率為17.7%; 3.18nM TL處理HT-1080細(xì)胞72小時(shí)后,MMP-9mRNA的表達(dá)明顯下調(diào),但MMP-2、TIMP-1/-2/-3/-4mRNA的表達(dá)無明顯變化;6nM和12nM TL處理組上述基因的mRNA表達(dá)均無明顯變化; 4.12nM TL處理HT-1080細(xì)胞72小時(shí)后,在細(xì)胞無血清培養(yǎng)基上清中檢測到的MMP-9的活性明顯下調(diào),18nM TL處理組無血
5、清培養(yǎng)基上清中則基本檢測不到MMP-9;3個(gè)藥物處理組MMP-2的活性均無明顯變化; 5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),18nM TL處理72小時(shí)后,穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,約相當(dāng)于對照組的65%;抗MMP-9單克隆抗體處理組穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)亦明顯減少,約相當(dāng)于對照組的50%;6nM和12nM TL處理組穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)均無明顯變化; 6.18nM TL處理HT-1080細(xì)胞72小時(shí)后,MMP-9基
6、因甲基化水平明顯上調(diào);6nM和12nM TL處理組MMP-9基因甲基化水平均無明顯變化; 7.18nM TL處理HT-1080細(xì)胞72小時(shí)后,DNMT-1和-3A mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào),DNMT-3B mRNA及蛋白表達(dá)無明顯變化;6nM和12nM TL處理組DNMT-1、-3A和-3BmRNA及蛋白表達(dá)均無明顯變化。 結(jié)論: 1.TL抑制HT-1080細(xì)胞的增殖; 2.TL可能通過抑制MMP-9的
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