脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架的研制及其生物相容性研究.pdf

1、目的： 研制交聯(lián)型天然脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架，并分析、評(píng)估其形態(tài)結(jié)構(gòu)、主要成分、生物相容性，為研制出理想的腦損傷修復(fù)支架提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1.脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架制備：(1)13月齡健康Sprague—Dawley(SD)成年大鼠10只，雌雄不限，體重為180±20g。消毒、麻醉后取出大鼠大腦，分離出腦皮質(zhì)后，運(yùn)用凍融、低滲、Triton X-100、脫氧膽酸鈉、DNA/RNA酶及Genipin交聯(lián)等方法處理，初步制成交

2、聯(lián)型脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架。(2)支架材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：解剖顯微鏡下觀察脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架制備過(guò)程中形態(tài)變化；并分別通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察支架材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征和三維立體構(gòu)型。(3)細(xì)胞外基質(zhì)成分分析：通過(guò)免疫組化的兩種方法對(duì)比正常腦組織和脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架中三種主要的細(xì)胞外基質(zhì)FN、LN和ColⅣ的含量和分布情況。2.脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架的生物相容性研究：(1)組織相容性：3月齡健康Sprague—Dawley(SD)成年大鼠

3、52只，雌性，體重為180±20g。隨機(jī)將動(dòng)物分為假手術(shù)組(陰性對(duì)照，4只)、新鮮腦組織組(陽(yáng)性對(duì)照，12只)、明膠海綿組(12只)、脫細(xì)胞支架組(12只)、交聯(lián)型天然脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架組(12只)；將樣本植入SD大鼠背部肌肉，于試驗(yàn)后1周、2周、4周、12周處死動(dòng)物，切取樣品及其周圍0.5～1 cm肌肉組織。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行HE染色觀察炎癥反應(yīng)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。(2)細(xì)胞相容性：神經(jīng)干細(xì)胞單層培養(yǎng)；取出生1天內(nèi)SD大鼠6只，雌雄不限，取

4、出神經(jīng)干細(xì)胞，在Gage和Ray方法的基礎(chǔ)上，改良單層培養(yǎng)細(xì)胞；倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)變化，并通過(guò)免疫熒光染色方法鑒定細(xì)胞類型及增殖情況。(3)細(xì)胞相容性檢測(cè)：將支架和神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、SD大鼠肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)1周觀察支架的毒性反應(yīng)；用支架浸提液(1：1和1：2)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞1周，通過(guò)MTT方法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，以神經(jīng)干單層培養(yǎng)基(DMEM/F12+N2+bFGF)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO做空白對(duì)照；將神

5、經(jīng)干細(xì)胞種植于交聯(lián)型脫細(xì)胞腦組織支架，1周后通過(guò)光鏡和電鏡觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)增殖以及與支架材料的粘附情況。 結(jié)果： 1.脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架制備。(1)支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)：成年SD大鼠新鮮腦組織經(jīng)脫細(xì)胞處理后，細(xì)胞成分已去除，形態(tài)上具有高度仿生的三維立體空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，親水性良好。經(jīng)Genipin交聯(lián)后支架材料空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得更為明顯，無(wú)菌保留3個(gè)月未見明顯降解，未見明顯細(xì)胞碎屑?xì)埩?。孔洞形態(tài)相似，孔徑大小相近，平均孔徑1

6、4.85±2.51μm，孔隙率達(dá)90.44％±2.16％。(2)細(xì)胞外基質(zhì)成分免疫組化分析：正常腦組織中細(xì)胞外基質(zhì)成分LN有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)N有陽(yáng)性表達(dá)，而ColⅣ為弱陽(yáng)性表達(dá)，主要分布于腦內(nèi)血管的基底膜上。經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理后的修復(fù)支架材料LN仍有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)、FN和ColⅣ均為弱陽(yáng)性表達(dá)。 2.脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架的生物相容性研究。(1)組織相容性(肌肉植入試驗(yàn))：所有大鼠均順利成活，無(wú)死亡，麻醉清醒后即可自由活動(dòng)。飲食正常，大小便

7、正常。假手術(shù)組在術(shù)后1周僅見少量淋巴細(xì)胞，1周后未見炎癥細(xì)胞。新鮮腦組織組術(shù)后第3天，1周、4周、12周試樣周圍均可見以嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)，可見大量毛細(xì)血管和小血管生成。未交聯(lián)腦組織支架組在術(shù)后3天可見少量中性粒細(xì)胞，并可見少量毛細(xì)血管生成。術(shù)后1周、4周可見少量淋巴細(xì)胞，毛細(xì)血管未見明顯增多；12周僅見少量淋巴細(xì)胞。明膠海綿組和交聯(lián)脫細(xì)胞腦組織支架組術(shù)后第3天、1周、4周試樣周圍有少量淋巴細(xì)胞。12周時(shí)淋巴細(xì)胞明顯較前減少

8、。按照GB/T14233.2-93炎癥細(xì)胞反應(yīng)分級(jí)結(jié)果顯示交聯(lián)脫細(xì)胞腦組織支架組反應(yīng)程度符合國(guó)標(biāo)要求，短期肌肉植入試驗(yàn)合格。(2)脫細(xì)胞腦組織修復(fù)支架的細(xì)胞相容性。神經(jīng)干細(xì)胞單層培養(yǎng)：神經(jīng)干細(xì)胞單層培養(yǎng)易于得到單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果表明：神經(jīng)巢蛋白(Neuroepithelial Stem Cell Protein，Nestin)陽(yáng)性率83％，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protei

9、n，GFAP)陽(yáng)性率1.8％，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuro-specific enolase，NSE)陽(yáng)性率95％，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-1-(2-deoxy—β—D—ribofuranosyl)uracil，BrdU)(+)。(3)細(xì)胞相容性：交聯(lián)支架與神經(jīng)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)1周，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，并可見細(xì)胞增殖；神經(jīng)細(xì)胞與支架共培養(yǎng)1周未見明顯死亡。支架浸提液(1：1和1：2)培養(yǎng)和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)

10、胞1周，MTT結(jié)果顯示三組間無(wú)明顯差異(P=0.128)，細(xì)胞生長(zhǎng)未受明顯抑制。神經(jīng)干細(xì)胞與交聯(lián)支架材料靜態(tài)共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖良好，7天時(shí)大量神經(jīng)干細(xì)胞與支架粘附，部分增殖成神經(jīng)球；HE可見細(xì)胞外基質(zhì)間大量細(xì)胞粘附；掃描電鏡下同樣可見大量神經(jīng)干細(xì)胞粘附在材料表面，部分細(xì)胞有突起生長(zhǎng)。 結(jié)論：1.初步研制的脫細(xì)胞腦組織支架立體空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，部分保留了細(xì)胞外基質(zhì)成分，生物相容性良好。2.改良單層培養(yǎng)法可成功培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，為實(shí)驗(yàn)提供